>[0018] 步骤1)中，所述厌氧培养是在37°C条件下厌氧培养24~48h。
[0019] 步骤1)所得纯化菌在所述乳酸杆菌选择性培养基上形成边缘整齐、表面光滑、有 溶钙圈、整齐度均一的乳白色圆形菌落；将该纯化菌菌株进行革兰氏染色，油镜下观察为杆 状的革兰氏阳性菌，单个或呈短链状排列。
[0020] 步骤2)中，1L所述的MRS培养基包含以下组分：牛肉浸出物10g、蛋白胨10g、酵 母提取物5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、梓檬酸二按2g、吐温800. lg、磷酸氢二钾2g、硫酸镁 〇? 58g、硫酸锰 0? 28g。
[0021] 步骤2)中，所述酸性的MRS培养基的pH值为3. 0。
[0022] 步骤2)中，所述的含有牛胆盐的MRS培养基中，牛胆盐的浓度为3. Og/L。
[0023] 步骤2)中，所述菌液中乳酸杆菌的浓度为2. 0 X 108cfu/ml ;300 y 1菌液对应加入 5. 0ml的含有牛胆盐的MRS培养基中。
[0024] 步骤3)中，所述大肠杆菌为标准大肠杆菌菌株ATCC25922 ;所述沙门氏菌为肠炎 沙门氏菌。
[0025] 一种上述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株在制备用于防治家禽细菌性消化道疾病的 微生态制剂方面的应用。
[0026] 本发明的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，为唾液乳酸杆菌（Lactobaci 1 lus Salivarius)L2,分离自健康鸡肠道内容物，在模拟胃肠道环境中能够耐受酸度pH3.0和 3g/L胆盐浓度；由生长曲线和产酸曲线可知，L2菌株对数生长期较长，产酸能力较强；通过 16S rRNA序列测序后比对可知，L2与唾液乳酸杆菌具有很高的同源性，可达99% ;体外抑 菌试验表明，L2菌株对大肠杆菌具有较强的抑制作用，在一定程度上也可抑制肠炎沙门氏 菌的生长；该菌株具有耐酸耐胆盐的特性且具有较高的抗大肠杆菌、沙门氏菌活性，生长迅 速、产酸能力强，可用于制备适宜于禽用的新型、高效的微生态制剂。
[0027] 本发明的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，从健康鸡肠道中通过选择性培养 分离筛选出乳酸杆菌，经耐胃酸和耐胆盐筛选，并对筛选出的菌株进行生长曲线、产酸能力 测定，通过平板抑菌试验，筛选出具有较强抑制致病性大肠杆菌特性的乳酸杆菌菌株；最后 通过16S rRNA测序，经Blast比对，鉴定为唾液乳酸菌；所得菌株具有耐酸耐胆盐的特性且 具有较高的抗大肠杆菌、沙门氏菌活性，生长迅速、产酸能力强，该菌株为禽用微生态制剂 的研制提供了菌种支持。
【附图说明】
[0028]图1为从家禽肠道筛选出的乳酸杆菌在乳酸杆菌选择性培养基上的菌落形态；
[0029]图2为分离的纯化菌菌株的显微镜检验形态；
[0030]图3为乳酸杆菌菌株在酸性的MRS培养基上的生长情况（OD_)检测结果；
[0031]图4为乳酸杆菌菌株在含牛胆盐的MRS培养基上的生长情况（OD_)检测结果；
[0032]图5为乳酸杆菌菌株耐梯度酸特性检测结果；
[0033] 图6为乳酸杆菌菌株耐梯度胆盐特性检测结果；
[0034] 图7为乳酸杆菌菌株48h生长曲线；
[0035] 图8为乳酸杆菌菌株48h产酸曲线；
[0036] 图9为优势菌株L2的抑菌活性检测结果，其中，a为对大肠杆菌ATCC25922的抑 菌效果，b为对肠炎沙门氏菌的抑制效果；
[0037] 图10为优势菌株L4的抑菌活性检测结果，其中，c为对大肠杆菌ATCC25922的抑 菌效果，d为对肠炎沙门氏菌的抑制效果；
[0038] 图11为优势菌株L10的抑菌活性检测结果，其中，e为对大肠杆菌ATCC25922的 抑菌效果，f为对肠炎沙门氏菌的抑制效果；
[0039] 图12为乳酸杆菌L2菌株16SrRNAPCR产物电泳图；
[0040] 图13为乳酸杆菌L2菌株与同源性较高细菌16Sr RNA的进化树。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
【具体实施方式】 [0042] 中，MRS肉汤（MRS培养基）、乳酸杆菌选择性培养基、pGEM-T载体和 pfu酶均购自宝赛生物；碳酸钙、牛胆盐、盐酸、氢氧化钠等所用试剂均为化学纯试剂。
【具体实施方式】 [0043] 中的数据处理：用Excel 2013处理乳酸杆菌耐酸耐胆盐特性的数 据和生长曲线及产酸曲线数据；将乳酸杆菌16S rRNA测序结果用Blast进行同源性比对。 对得到的同源性较高的序列采用MEGA5. 0构建进化树。
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法及鉴定过程如下：
[0046]1.菌株分离纯化：
[0047] 取健康雏鸡盲肠内容物1.00g，用5ml无菌水稀释后，用纱布过滤以除去盲肠内容 物中的固体残渣，得滤液；取〇. 5ml滤液依次用无菌水倍比稀释至1(T7,取IO'10'KT三 个稀释度各1〇〇 u 1，均匀涂布在乳酸杆菌选择性培养基平板上，37°C厌氧培养24h，分离出 具有溶钙圈的单菌落，并进行反复划线纯化，直至得到纯化菌L1~L10的菌落；所述划线纯 化用的是乳酸杆菌选择性培养基。
[0048] 其中，1L所述的乳酸杆菌选择性培养基包含以下组分：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、 酵母浸粉2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、枸橼酸三铵2g、硫酸镁0. 2g、硫酸锰0. 05g、吐温 801g、葡萄糖20g、碳酸妈5g、琼脂25g。
[0049] 2?形态鉴定：
[0050] 对分离得到的纯化菌进行菌落形态观察，并对分离的单菌落进行革兰氏染色，油 镜下观察细菌的形态及染色情况，并根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》进行鉴定；
[0051] 形态观察结果：37°C厌氧培养24h后，乳酸杆菌选择性培养基上形成边缘整齐、表 面光滑、有溶钙圈、整齐度均一的乳白色圆形菌落（如图1所示）；将分离的纯化菌菌株进 行革兰氏染色，油镜下可见呈杆状的革兰氏阳性菌，单个或呈短链状排列（如图2所示）。
[0052] 3.初筛菌株在梯度酸和胆盐环境（模拟胃肠道环境）中的抗性：
[0053] 取MRS培养基：1L所述的MRS培养基包含以下组分：牛肉浸出物（牛肉浸粉）10g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、醋酸钠5g、梓檬酸二按2g、吐温800. lg、磷酸氢二 钾2g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰0. 28g ;将上述各组分溶于水后，用高压锅在121°C灭菌15min， 调节pH为6. 2~6. 4,即得。
[0054] 分别配制牛胆盐质量浓度为0.Og/L (对照）、1. 0g/L、2. 0g/L、3. Og/L的MRS培养 基和pH值为3. 0、4. 0、5. 0、6. 3 (对照）、7. 0的MRS培养基。
[0055] 取步骤1所得纯化菌L1~L10分别制成乳酸杆菌菌液，用麦氏比浊仪将乳酸杆菌 菌液浓度调整为2. OX 108cfu/ml，得菌悬液；分别取300 y 1相应的菌悬液加入5. 0ml的pH 为3. 0、4. 0、5. 0、6. 3 (对照）、7. 0的MRS培养基和牛胆盐浓度为0. 0 (对照）、1. 0g/L、2. 0g/ L、3. 0g/L的MRS培养基，每组三个重复，37°C厌氧培养4h后，用紫外分光光度计检测菌液 〇D_值，结果如图3、图4所示。
[0056] 从图3、图4可以看出，乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10在pH值为3. 0的MRS培养 基、含3. 0g/L的牛胆盐的MRS培养基（模拟胃肠道环境）中生长良好。
[0057] 考察乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10耐梯度酸和胆盐的特性，结果如图5、图6所示。 从图5、图6可以看出，乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10模拟胃肠道环境具有较高耐受力。
[0058] 4.耐酸耐胆盐菌株生长曲线及产酸曲线：
[0059] 分别取乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10的菌悬液（乳酸杆菌浓度为2. OX 108cfu/ ml) 300 y 1，置于100ml的MRS培养基中，37°C厌氧静置培养，并每隔2h取样一次，连续取到 48h，用紫外分光光度计测不同时间段所取菌液的0D 6(J直（结果如图7所示），用精密酸度 计检测不同时间段所取菌液的pH值（结果如图8所示）。
[0060] 从图7可以看出，乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10的潜伏期均很短，很快就进入对数 生长期；L2、L10菌株前14h生长迅速，0D 6(J直直线上升，14~30h，菌体密度基本趋于平衡， 〇D6J直稳定在2. 5左右；L4菌株前12h生长较快，12~48h期间OD 6(J直基本稳定在2. 2左 右；菌株L10较L2稍早进入稳定期，30~48h，L2菌株有缓慢生长的趋势，而L10菌株0D_ 值基本维持在2. 5左右。
[0061] 图8显示的是乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10培养液在48h内pH的变化情况。从 图8可以看出，MRS液体培养基的初始pH为6. 37,加入菌液浓度为2. OX 108cfu/ml的L2、 L4、L10菌悬液300ul后，pH分别变为6. 01、6. 21、6. 17 ;37°C厌氧培养，三株菌前16h菌体 很快进入对数生长期，代谢速度加快，产酸量显著增加，pH值迅速下降，其中L2菌株最为明 显；16h后L4、L10菌株几乎不再产酸，pH稳定在4.0左