专利名称：μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法
技术领域：
本发明涉及μ -芋螺毒素-KIIIA的制备方法，尤其涉及μ -芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法，属于μ -芋螺毒素-KIIIA的制备领域。
背景技术：
近年来，随着分子生物学与电生理，尤其是膜片钳技术的发展，人们认识到Na+通道的结构和功能变化是慢性疼痛的病理生理机制，应用特异性的Na+通道亚型阻止药治疗慢性顽固性疼痛可取得良好的效果。μ-芋螺毒素是高度特异的Na+通道阻滞剂，可以区分Na+通道的不同亚型 (Shon K, Olivera BM, Watkins M, et al. μ -Conotoxin PIIIA, a new peptide for discriminating among tetrodotoxin-sensitive Na channel subtypes.)，因其序歹llfei， 活性高，选择性强，已证实具有显著的镇痛效果O7Usetani N. Drugs from the sea. Karger Basel Freiburg Paris London New York. 2000 ; 1-5.)，对于发展钠通道探针及镇痛药物具有重要意义。高选择性的TTX-R钠通道抑制剂对神经性疼痛或炎症痛非常有效，且副作用低。 作用于TTX-R VSSCs的芋螺毒素μ -SmIIΙΑ, SIIIA和KIIIA等，已发现具有显著的镇痛作用(Haefner B.Drugs from the deep -marine natural products as drug candidates. Drug Discov Today. 2003 ；8 (12) :536-544.)，目前芋螺毒素的获得主要是直接提取或人工化学合成(权规茹，罗素兰，林秋金，长孙东亭，张本.芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究.中国海洋药物杂志.2005 ;24 (2) :1-5.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用基因工程获得μ -芋螺毒素--ΚΙΙΙΑ的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种μ-芋螺毒素--ΚΙΙΙΑ的基因工程制备方法，包括将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。其中，所述的μ -芋螺毒素-KIIIA基因是通过合成单链DNA序列，形成双链目的 DNA序列而获得的；所述的带有Trx-tag的原核表达载体优选为pET_3h⑴；硫氧还蛋白 (Thioredoxin, Trx)是一组小分子蛋白质，分子量约为lld，广泛存在于真核生物和原核生物中，它们都包含二硫键活性位点序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，是巯基-二硫键氧化还原酶。其主要作用是可以增加重组蛋白的可溶性，使蛋白质在大肠杆菌中可溶性表达，有利于蛋白纯化和活性的研究。大肠杆菌表达系统是目前基因工程中比较成熟、经典的表达方法。 而PET表达体系则为该系统中的经典，本发明采用了 pET载体作为蛋白表达载体，该载体的特点是带有Trx-tag，会产生Trx和目的蛋白的融合蛋白。
所述的重组表达载体的构建包括以下内容pET-3h(+)载体的酶切；酶切产物的胶回收及纯化；目的序列和载体的连接；连接产物的鉴定。连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。针对于μ-芋螺毒素二硫键较多结构较复杂的特点，本发明优选大肠杆菌 0rigami2(DE3)为大肠杆菌宿主菌。0rgami2 (DE!3)为K-12衍生的宿主菌，具有硫氧还蛋白还原酶突变型(trxB)和谷胱甘肽还原酶(gor)突变型基因，具有增加胞浆内二硫键的形成的特性。0rgami2(DE3)表达的活性蛋白量比其它大肠杆菌宿主菌高10倍以上，是表达富含二硫键蛋白的理想宿主。即使和其他大肠杆菌宿主菌的总体表达水平相似，0rgami2(DE3) 表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Orgami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。本发明对IPTG诱导目的蛋白的表达条件进行了优化和筛选，结果发现，初始菌浓度(OD6J以及诱导时间对于蛋白表达量有着较为显著的影响，进一步的实验发现，当0D_ =l.o左右时，蛋白表达量最高。当诱导时间为20h，蛋白的表达量增加率最高。所述的蛋白的纯化方式包括将重组蛋白上Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析，收集洗脱峰，用kphadex G25凝胶过滤除盐，即得。本发明利用Trx和0rgami2(DE3)对蛋白空间构成的特殊性质，建立了表达了融合蛋白芋螺毒素KIIIA(Trx-CTX)的基因工程方法，本发明基因工程表达的融合蛋白 μ-芋螺毒素KIIIA具备与天然蛋白相同的构像、活性。小鼠福尔马林实验，小鼠扭体模型，小鼠热板模型等实验证实具有优秀的镇痛活性。本发明基因工程方法具有融合蛋白产量大，易于提取、纯化方便，中间流程少等特点，建立了一个方便、经济获得μ-芋螺毒素 KIIIA的途径，为将μ -芋螺毒素-KIIIA开发成临床镇痛药奠定了基础。
图1为本发明目的基因电泳图；1.单链目的DNA ;2.单链目的DNA ;3. DNA marker ； 4.双链目的基因。图2为本发明重组质粒酶切鉴定图；1. DNA marker ；2. pET-32a ；3.被BamH I消化的pET-32a ；4.重组质粒；5.被BamH I消化的重组质粒。图3为本发明重组质粒中目的基因序列测定图。图4为本发明Trx-CTX的免疫印迹分析图。图5为本发明不同0D600值时诱导表达结果图；1.未诱导；2.蛋白标准marker ； 3. 0. 11 ；4. 0. 23 ；5. 0. 47 ；6. 0. 65 ；7. 0. 77 ；8. 0. 94 ；9. 1. 16。图6为本发明不同诱导剂浓度诱导蛋白表达结果图；1.未诱导2.诱导的 pET_32a ；3.标准蛋白 markers ；4. 0. lmmol/L ；5. 0. 2mmol/L ；6. 0. 4mmol/L ；7. 0. 6mmol/L ； 8. 0. 8mmol/L ；9. 1. Ommol/L ；10. 1. 2mmol/L。图7为本发明不同时间诱导蛋白表达结果图；1.标准蛋白markers ；2.未诱导； 3. Ih ；4. 2h ；5. 4h ；6. 6h ；7. 8h ；8. IOh ；9. 20h。图8为本发明所制备的蛋白过镍琼脂糖凝胶的电泳结果图。图9为本发明蛋白过镍琼脂糖凝胶洗脱曲线。图10为本发明蛋白经凝胶过滤除盐洗脱曲线；1.纯化的Trx-CTX ；2. imidazole
4和其它。图11为本发明Trx-CTX对小鼠福尔马林实验的影响图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验试剂
限制性内切酶Kpn I、EcoR INEB
限制性内切酶BamH ITakaRa
T4-DNA连接酶NEB
T4多核苷酸激酶TakaRa
酵母粉上海生工
胰蛋白胨上海生工
氨苄青霉素哈尔滨制药总厂
氯化钠国产分析纯
琼脂粉上海生工
SDS-PAGE (5%浓缩胶，15%分离胶)
TEMEDBio-Rad
过硫酸铵Bio-Rad
聚丙烯酰胺Promaga
甲叉聚丙烯酰胺Promaga
蛋白质MarkerTakaRa
DNA MarkerTakaRa
十二烷基硫酸钠(SDS)Sigma
异硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)TakaRa
考马斯亮蓝G250TakaRa
TrisSigma
甘氨酸Sigma
EDTABoehringer Mannheim
溴酚兰国产分析纯
考马斯亮蓝测蛋白试剂盒南京建成生物工程研究所
Ni-NTA树脂Novagen
Sephadex G-25Amersham
生理盐水国药集团化学试剂有限公司
醋酸丹东市胜利化工厂
盐酸吗啡沈阳第一制药厂批号050501
大肠杆菌 Origami2 (DE3)Novagen
Pet-32a (+)NEB实施例1 μ -芋螺毒素-KIIIA基因的表达和纯化一、实验方法(一)、μ-芋螺毒素-KIIIA基因的获得1、合成单链DNA序列根据μ -芋螺毒素-KIIIA氨基酸序列，按照大肠杆菌偏爱密码子设计其DNA序列，5’端添加Kpn I酶切位点和肠激酶识别序列，3’端添加TAA终止密码子及EcoR I酶切位点。具体序列如下5' -C GAC GAC GAC GAC AAG TGC TGC AAC TGC AGC AGC AAA TGG TGC CGT GAT CAT AGC CGC TGC TGC TAA G_3'3' -CATGG CTG CTG CTG CTG TTC ACG ACG TTG ACG TCG TCG TTT ACC ACG GCA CTA GTA TCG GCG ACG ACG ATT CTTAA-5‘；2、形成双链目的DNA序列将上述合成的两条单链DNA分别用T4多核苷酸激酶磷酸化、退火成为双链DNA，具体步骤如下首先将合成的DNA单链分别溶于300 μ L与200 μ L去离子水中，终浓度约为 10 μ mol/L ；将两条单链5'端磷酸化，反应体系见表1 表 权利要求
1.一种μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制备方法，包括将μ-芋螺毒素KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌(E. Coli)，IPTG诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。
2.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于所述的芋螺毒素-KIIIA基因是通过合成单链DNA序列，形成双链目的DNA序列而获得的。
3.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于所述的带有Trx-tag的原核表达载体为pET-32a(+)。
4.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于所述大肠杆菌(E.Coli)是大肠杆菌 0rigami2(DE3)。
5.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于IPTG诱导目的蛋白的表达的条件是OD6tltl = 1.0。
6.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于所述诱导时间为20小时。
7.按照权利要求1所述的基因工程制备方法，其特征在于，所述的蛋白的纯化方式包括将重组蛋白上Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析，收集洗脱峰，用S印hadex G25凝胶过滤除盐，即得。
全文摘要
本发明公开了一种μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制备方法，包括将μ-芋螺毒素-KIIIA基因插入带有Trx-tag的原核表达载体构建得到重组原核表达载体；将所述的重组原核表达载体转化大肠杆菌，诱导目的蛋白的表达；收集并纯化所表达的蛋白，即得。本发明利用Trx和Orgami2(DE3)对蛋白空间构成的特殊性质，建立了表达了融合蛋白μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程方法，所制备的融合蛋白具备与天然蛋白相同的构像、活性。动物实验证实，所制备的融合蛋白具有优秀的镇痛活性。本发明方法具有融合蛋白产量大，易于提取、纯化方便，中间流程少等特点，建立了一个方便、经济的获得μ-KIIIA的途径。
文档编号C12N15/09GK102154257SQ20101058881
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者李凤兰, 李晖, 李金波, 管荟苓, 董钦, 蒋倩倩, 赵雪娇, 马健慧 申请人:哈尔滨医科大学