专利名称：一种海带孢子体dna的制备方法
技术领域：
本发明涉及海带孢子体DNA的制备，具体地说是一种有效去除褐藻多糖的海带孢子体DNA的制备方法。
背景技术：
海带是我国重要的经济海藻之一，它含有丰富的碘、蛋白质及各种人体必需的矿物元素。除了食用和药用价值外，海带所产生的褐藻酸和甘露醇是经济价值很高的工业原料。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子生物学技术已应用到海带的遗传与变异、种质鉴定及系统发育等方面的研究中，而进行分子生物学研究的前提条件是制备高纯度的海带孢子体总DNA。众所周知，褐藻多糖如半乳糖及其衍生物和褐藻酸等一直是制约褐藻DNA制备的一个主要因素。与高等植物褐藻多糖相比，褐藻孢子体内的褐藻多糖含量高，粘性大且是水溶性的。由于褐藻多糖能够吸附DNA并与DNA共沉淀，导致所制备的DNA产量低，纯度差， 进而导致后续常规的分子生物学操作无法进行，如限制性内切酶反应，PCR反应等。因此， 制备高纯度，得率高的海带孢子体DNA是进行分子生物学研究的基础。目前，关于褐藻DNA制备方法的已有一些报道。一是利用超速离心来去除褐藻多糖以纯化DNA，但这种方法需要大量的海带孢子体材料。二是利用^^1!虹0如spin柱的方法来去除海带孢子体中的褐藻多糖。三是运用CTAB方法，在Sargassum polycystum和 S. siIiquosum的DNA制备中有效地去除褐藻多糖，以此DNA为模板，成功地进行了 PCR反应。四是将褐藻酸裂解酶和CTAB结合来去除褐藻多糖。首先是用褐藻酸裂解酶裂解海带孢子体组织细胞，去除海带孢子体组织表面及细胞壁外褐藻多糖，再利用CTAB方法去除细胞内剩余的褐藻多糖。上述制备海带孢子体DNA的方法，过程繁琐，既费时费用又很高，而且褐藻多糖去除的不是很彻底。
发明内容
本发明提供了一种海带孢子体DNA的制备方法，可以解决现有技术存在的褐藻多糖去除不够彻底、过程繁琐、既费时费用又高的问题。本发明的目的在于提供一个简单易行的、适用于实验室常规制备海带孢子体DNA 的方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现一种海带孢子体DNA的制备方法，包括如下步骤1)取海带孢子体在清水中反复清洗，以去除海带孢子体表面的杂质，并在液氮中迅速将海带孢子体研成藻粉粉末，研磨1-6次；液氮研磨使海带孢子体组织细胞破碎，释放细胞内DNA ；2)将上述藻粉粉末转65°C预热的SDS提取缓冲液中，63_65°C水浴保温60min ；3)加入占上述溶液1/3体积的KAc溶液，混合均勻，第一次去除褐藻多糖；KAc溶液浓度为 5mol Γ1, ρΗ 7. 5 ；4)离心，取上清，加入异丙醇；离心条件室温IOOOOrpm(10621 Xg)离心30min,
取上清，加入等体积异丙醇沉淀DNA ；5)离心，弃上清，加入CTAB提取缓冲液使DNA进一步溶解，65°C保温15min，第二次去除褐藻多糖；离心条件室温12000rpm离心IOmin ；6)离心(离心条件室温12000rpm离心IOmin)，水相加入两倍体积的KAc溶液， 离心(室温IOOOOrpm离心20min)，第三次去除褐藻多糖；7)加入上述溶液等体积的氯仿与异戊醇混合液，去除蛋白质等杂质；8)离心，(离心条件室温12000rpm离心lOmin)，水相用冷的异丙醇于-18 至_20°C沉淀；9)离心，用70%冷乙醇(重量百分比浓度)洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase， 终浓度为0. 1 μ g μ Γ1,以消化RNA，得终产品海带孢子体DNA ；离心条件室温12000rpm离心 15min。本发明通过三次去除褐藻多糖，并且CTAB提取缓冲液和KAc溶液配合使用，使得褐藻多糖去除的更彻底，并且操作简单，省时省力。进一步地，所述步骤1)中于液氮中研磨时，液氮中加入10%海带孢子体重量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。进一步地，所述SDS提取缓冲液的组成为2. 0% sodium dodecylsulfate (SDS)， 5Ommol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA), IOOmmol L-1 Tris. HCl, ρΗ 8. 0, 500mmol L-1 NaCl,2% β-巯基乙醇。进一步地，所述氯仿与异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为M 1。进一步地，所述CTAB 提取缓冲液的组成为200mmol L^1Tris-HCl,ρΗ 8. 0,50mmol L1 ethylenediaminetetra-acetic acid,2mol L1 NaCl,2% cetyltrimethyl ammonium bromide。DNA浓度及纯度测定在获得产品海带孢子体DNA后，将制备的DNA溶解在TE缓冲液中，1)应用普通琼脂糖电泳进行DNA分子量大小的检测，幻使用BioWwtometer进行DNA浓度及纯度测定。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是1、速度快。本发明DNA提取步骤简化，整个制备DNA过程在5_他内完成。2、效果好。本发明有效地去除了褐藻多糖；得到了纯度较高(OD26tlA)D28ciS 1. 7-1. 9)的海带孢子体DNA03、提取效率高。本发明在液氮中研磨，可使胞外或胞内核酸酶失活，减少了 DNA的降解；产量为30 μ g g—1 (湿重)，能够满足常规分子生物学实验要求。4、无污染。本发明避免了使用有毒化学药品。5、操作费用较低。本发明在制备DNA的过程中没有使用蛋白酶K等试剂。
图1为海带孢子体DNA普通琼脂糖电泳图谱；图2以本发明制备的DNA为模板扩增出ITS基因的部分片段的电泳图谱；
图3为以本发明制备的DNA为底物进行限制性酶切反应的电泳图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。实施例1海带孢子体DNA的制备将用清水反复冲洗的0. 2-0. 3g新鲜的海带孢子体置于液氮中，加入0. 02g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，迅速研成粉末(1-6次)；将藻粉转入65°C预热的SDS提取缓冲液[2. 0% sodium dodecyl sulfate (SDS),50mmol L1 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA), 50mmol L-1 Tris-HCl, pH 8. 0,500mmol L-1 NaCl,2% β-巯基乙醇]的离心管中，边加热边混合均勻，65°C水浴保温60min ；加入1/3的体积的5mol L—1 KAc,混合均勻，冰上放置30min ；IOOOOrpm(10621 Xg)离心IOmin ；取上清，加入等体积异丙醇，室温12000rpm 离心 IOmin ；弃上清，水相加入 CTAB 缓冲液[200mmol L^1Tris-HCKpH 8. 0) ,50mmol Γ1 ethylenediaminetetra-acetic acid(EDTA),2mol L-1 NaCl, 2% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) ]，65°C保温15min，第二次去除褐藻多糖；IOOOOrpm离心20min ；水相用两倍体积的KAc溶液，离心(室温IOOOOrpm离心20min)，第三次去除褐藻多糖；加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)抽提lOmin，室温12000rpm离心IOmin ；取上清，水相加入1倍体积的冷异丙醇沉淀，_20°C沉淀30min ； 12000rpm室温离心15min ；用冷70%乙醇洗DNA沉淀， 稍干后溶于TE中，加入RNase，终浓度为0. Iyg μ Γ1。使用BioWiotometer进行DNA浓度及纯度测定；普通琼脂糖凝胶电泳染色后显示所提取的海带DNA大小在23. OKb以上。具体应用1 以本发明实施例1制备的DNA为模板，扩增出ITS基因的部分片段(图 3)。PCR扩增所用正向引物为LB1 :5，CGCGAGTCATCAGCTCGCATT3’，反向引物为LB2 5，AGCTTCACTCGCCGTACTGG3，。PCR 反应组成反应总体积为 25 μ L。IXPCR buffer (50mM KCl，0· 01 % gelatin, IOmM Tris. HCl, pH 9. 0), 2. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTP，0. 2 μ M 引物， 40-50ng DNA，，2. OU Taq 酶。反应参数为94°C预变性 2min，94°C 60s，55°C 90s，72°C 150s, 35个循环，72°C延伸IOmin0进行测序，正向测序结果如下GGGAATCCTGTCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACCTACCGATTGAATGTTTCGGTGAAGATTCCGG ACTGTGGCTCGCGTGCTTCACGGCGCTCTTGCCGTGGGAAGTTATCTAAACCTCAACATTTAGAGGAAGGTGAAGT CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAAAGCGGGTTCGTTCAATCCCCCCCGCTCT ATAAATTGTCTGTGAGGCCGCTTCGTGCGGCCTCTTTACCCCGAGAAAGAATTCGTTATGCGAAGTTGGGCGAGG GGCGCCTCGCCGAGAGCCTGTGAAAAGGCCCTCGAATCAAAGCGCACCCCACATTTCAACCCATTAAACTCTGAA TCTGAACTCAAAGGGGCGCTGCGCTAGCCGCGGCTCCCCCAACCTTTAACGTTGTAAAACTTTCAGCGACGGATG TCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTCTTGCGACTTGCAGAATCCAGTGAATCATC AAAACTTTGAACGCATCTTGCGCTTCCGGGATACTCCTGGGAGCATGCTTGTCGGAGTGTCTGTTGACACCACTC GCCCCTCTTCTCTCCTGTCTCACGACGGGGGAGTCGCGGCGGCGGACTTTGAGTGTTCCGGAGTTCCCATGCTCC GAGTGCACCTAATCTCGTGAACGAAGCCTCTCGCGCCCTGCCGCACAGAGTTGTTGACGGCGCTCGCTTCGGCGG CGACTCTCGACTCACCAAACGTGCGCAGGATGCCTGCCTCATTCCGGCGCTCCGACGCCGACCCTTCTGGGTCAGCGTTGGAAACCGTACCACTTTCGTTCGGACCTCCGATCAAGCAAGAGGACCCGCTGAATTTAAGCATATAACTAA GCGGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATT反向测序结果如下CGGGGGGCTTGCTTCTTTTCTCCGCTTAGTTATATGCTTAAATTCAGCGGGTCCTCTTGCTTGATCGGA GGTCCGAACGAAAGTGGTACGGTTTCCAACGCTGACCCAGAAGGGTCGGCGTCGGAGCGCCGGAATGAGGCAGGCAT CCTGCGCACGTTTGGTGAGTCGAGAGTCGCCGCCGAAGCGAGCGCCGTCAACAACTCTGTGCGGCAGGGCGCGAGAG GCTTCGTTCACGAGATTAGGTGCACTCGGAGCATGGGAACTCCGGAACACTCAAAGTCCGCCGCCGCGACTCCCCCG TCGTGAGACAGGAGAGAAGAGGGGCGAGTGGTGTCAACAGACACTCCGACAAGCATGCTCCCAGGAGTATCCCGGAA GCGCAAGATGCGTTCAAAGTTTTGATGATTCACTGGATTCTGCAAGTCGCAAGACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCT TCATCGTTGTGGGAGCCAAGACATCCGTCGCTGAAAGTTTTACAACGTTAAAGGTTGGGGGAGCCGCGGCTAGCGCA GCGCCCCTTTGAGTTCAGATTCAGAGTTTAATGGGTTGAAATGTGGGGTGCGCTTTGATTCGAGGGCCTTTTCACAG GCTCTCGGCGAGGCGCCCCTCGCCCAACTTCGCATAACGAATTCTTTCTCGGGGTAAAGAGGCCGCACGAAGCGGCC TCACAGACAATTTATAGAGCGGGGGGGATTGAACGAACCCGCTTTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGG AAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGTTGAGGTTTAGATAACTTCCCACGGCAAGAGCGCCGTGAAGCAC GCGAGCCACAGTCCGGAATCTTCACCGAAACATTCAATCGGTAGGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGAC GTAATCAATGCDNA正反向测序结果与GenBank上已登录的海带ITS序列进行比对，同源性达 99%以上，可判断为海带的ITS序列。具体应用2 以本发明实施例1制备提取的DNA为底物，进行限制性酶切反应，酶切反应图谱如图3所示。酶切底物为1-2 μ g海带孢子体DNA，限制性内切酶分别是EcoRI，Sau3Al和 HindIII0酶切反应时间为6-7h。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
权利要求
1.一种海带孢子体DNA的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)取海带孢子体在清水中反复清洗，以去除海带孢子体表面的杂质，并在液氮中迅速将海带孢子体研成藻粉粉末；2)将上述藻粉粉末转入SDS提取缓冲液中，63-65°C保温60min；3)加入KAc溶液，混合均勻，第一次去除褐藻多糖；4)离心，取上清，加入异丙醇；5)离心，弃上清，加入CTAB提取缓冲液，第二次去除褐藻多糖；6)离心，在水相加入KAc溶液，第三次去除褐藻多糖；7)加入氯仿与异戊醇混合液抽提；8)离心，水相用异丙醇于-18至-20°C沉淀；9)离心，用70%冷乙醇洗沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得终产品海带孢子体DNA。
2.根据权利要求1所述海带孢子体DNA的制备方法，其特征在于所述步骤1)中于液氮中研磨时，液氮中加入10%海带孢子体重量的聚乙烯吡咯烷酮。
3.根据权利要求1所述海带孢子体DNA的制备方法，其特征在于所述SDS提取缓冲液的组成为2· 0% sodium dodecyl sulfate, 50mmol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid, IOOmmol L^1Tris-HCl, pH 8. 0,500mmol L-1 NaCl,2% β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1所述海带孢子体DNA的制备方法，其特征在于所述氯仿与异戊醇混合液中，氯仿与异戊醇的体积比为24 1。
5.根据权利要求1所述海带孢子体DNA的制备方法，其特征在于所述CTAB提取缓冲液的组成为:200mmol L—1 Tris-HCl, pH 8. 0，50mmol L—1 ethyl enediaminetetra-acetic acid，2mol L—1 NaCl，2% cetyltrimethyl ammonium bromide。
全文摘要
本发明提供了一种海带孢子体DNA的制备方法，可以解决现有技术存在的褐藻多糖去除不够彻底、过程繁琐、既费时费用又高的问题。技术方案步骤如下，1)取海带孢子体在清水中反复清洗后置于液氮中，迅速研成粉末；2)将藻粉转入SDS提取缓冲液中，65℃保温60min；3)加入KAc溶液，混合均匀，第一次去多糖；4)离心，取上清，加入异丙醇沉淀DNA；5)离心，弃上清，加入CTAB溶液第二次去多糖；6)离心，水相用KAc溶液第三次去多糖；7)加入氯仿∶异戊醇抽提；8)重复4)步，9)离心，70％冷乙醇洗DNA沉淀，稍干后溶于TE中，加入RNase，得产品。本发明的优点速度快，效果好，提取效率高，无污染，操作费用较低。
文档编号C12N15/29GK102154308SQ20101058869
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者姜春梅, 王莎莎, 王高歌 申请人:中国海洋大学