专利名称：一种改进细胞色素p450酶家族体外表达的方法
技术领域：
本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达 的方法。
背景技术：
细胞色素P450 (CYP450)酶是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，是 I相反应中活性最强的代谢酶，可参与许多前致癌物和前毒素的代谢活化，生成亲电性很强 的中间产物或终产物，引发一系列的毒性效应。现有研究CYP450酶代谢活化外源化合物的 途径主要分体内和体外代谢两种。体内代谢研究以动物模型为代表，但不同种属的动物与 人之间存在较大的差异，尤其是在代谢方面，参与化合物代谢的酶种类、酶的贡献程度、反 应类型以及代谢产物等均可能不相同，把动物实验结果外推到人体误差高且准确性低。此 外，CYP酶的代谢底物非常广泛，每个CYP酶都有其特异的代谢谱，开展单种代谢酶对毒物 的代谢特征研究就需要得到单一组分的CYP酶，动物体内代谢中参与化合物代谢的酶种类 繁多，难以达到目的。随着对CYP酶的深入认识，人们开始通过各种方法得到单一的纯酶， 构建各种体外代谢系统，对外源化合物的体外代谢进行研究。最初，人们通过纯化哺乳动物 肝或肾中的CYPs得到单一的纯酶再进行研究，但CYPs家族中的各种代谢酶的性质非常 接近，很难得到纯酶，或者产量很低。到了 20世纪90年代，随着分子生物学、生物化学的 飞速发展，通过在异源表达系统中表达得到纯CYPs酶已成为得到单一纯酶并进而开展化 学物体外代谢的主要方法手段。到目前为止，几个常用的表达体系，如细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等系 统都已被用于CYP450S的表达。其中杆状病毒昆虫细胞(BaCul0Virus/Sf9)表达系统可 高效表达外源基因，且昆虫细胞的蛋白加工和修饰方式与哺乳动物细胞相似，可实现较为 正确的蛋白糖基化、分泌和组织定位表达，且蛋白表达量高，可以高水平表达多种原始的 CYP450蛋白。但CYP450蛋白的异源表达除了需要有完整的细胞、亚细胞结构、正确的蛋白 糖基化、分泌和组织定位表达外，还需要有血红素等辅助因子的参与，同时CYP450酶活性 的发挥还需要细胞色素P450氧化还原酶(P0R)、NADPH等辅酶为其提供电子，所以如何在各 种异源表达系统中得到高量、有酶活性的CYP450蛋白成为了化合物体外代谢的关键点和 难点。如前所述，CYP450S酶类需要在血红素铁上加入两个电子(即被还原后)才能行使 其活性，这种电子一般由与CYP450短暂结合的蛋白作为电子供体，从辅基中传递而提供。 哺乳动物CYP450S作为膜结合蛋白质，有些位于线粒体内膜，有些位于内质网，共有两条不 同的电子传递链，CYP450s的位置不同电子传递链也不同，在内质网中为CYP450提供电子 的蛋白是POR蛋白。人的POR蛋白是一种膜结合的黄素蛋白，它由相同比例的FMN和FAD黄 素蛋白组成，存在于大多数真核细胞中，是一些内质网结合的加氧酶蛋白的电子供体蛋白，它可以从NADPH为CYP450s提供电子。为系统研究CYP450对化合物的代谢活化作用，提高体外代谢反应效率，因此研究 CYP450和POR非常有必要。但采用经典方法制备CYP450和POR的时，发现其得率很低，难 以满足研究需求。本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，使得CYP450 和POR能高效表达且活性较高。
发明内容
发明目的本发明的目的在于本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表 达的方法，使得CYP450和POR能高效表达且活性较高。技术方案
一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤4所述的有关辅助 因子的 4 种条件之一① 0. 5-6 μ g/ml Hemin ；② 0. 05-0. 6mM 5-ALA ；③ 0. 01-0. 4mM Fe3+ ； ④ 0.05-0. 6mM -ALA 和 0.01-0. 4mM Fe3+混合物。最优化的条件为 0. 2 mM 5-ALA 与 0. 02mM Fe3+混合物。具体制备方法如下(以CYP2A13和POR为例)
1、重组转移载体pFastBacl-CYPs/POR质粒的构建与鉴定
pFastBacl-CYP2A13为本实验室保存。双酶消化重组质粒pcDNA3. 1 (+) /POR和转移质 粒载体pFastBac 1，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段。用T4 DNA连接酶连 接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒pFastBacl-POR。经氨 苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质 粒 DNA。使用双酶切消化验证 pFastBacl-CYP2A13 和 pFastBac 1-P0R。2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBac 1-CYPs/POR重组质粒转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，在 DHlOBac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYPs/POR的基因片段 插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重 组 Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用 PCR 反应进行验证。3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/POR的获得
在6孔板接种9X IO5个细胞/孔，27°C贴壁lh。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试 剂复合物对细胞进行转染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液(含青霉素100 IU/ml ；链霉素100 μ g/ml)，27°C孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目 的基因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保 存备用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。4、重组CYP450s/P0R蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的CYP450蛋 白。感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分 装后-80°C保存备用。以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳， 以免疫印迹法检测CYP2A13和POR蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用 Image J 1. 43软件对条带进行灰度值分析。
5、CO-差示光谱法检测CYP450蛋白活性
采用CO差示光谱法检测CYP450蛋白酶活性微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀 释至lmg/ml，取Iml加入到Icm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混 勻后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混勻使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计 的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒 体蛋白中CYP450蛋白的含量。6、细胞色素C分析法检测POR蛋白活力
在Icm光径的比色皿中加入0. 84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0. Iml 0. 8 mM细 胞色素C，再加入20μ1稀释适当倍数的微粒体悬液，混勻后测定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3 分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。有益效果
1，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予 0. 02mM Fe3+和0.2mM 5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为 5pfu/细胞、POR的MOI为2 pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。2，该条件的优化和建立，为体外高效表达外源代谢酶并开展药物和毒物的体外代 谢研究提供了重要的平台。该条件具有一定的普适性，可适用于多种体外活性蛋白的表达。 一经推广，将产生良好的社会效益和可观的经济效益。
图1.不同条件辅助因子对CYP2A13表达的影响，其中A为Immunoblotting检测 加入不同浓度的Hemin后CYP2A13蛋白表达差异，B为A图经过Image J 1. 43软件对条 带进行灰度值分析后的结果；C为Immunoblotting检测加入不同浓度的5-ALA后CYP2A13 蛋白表达差异，D为C图经过Image J 1. 43软件对条带进行灰度值分析后的结果；E为 Immunoblotting检测加入不同浓度的Fe3+后CYP2A13蛋白表达差异，F为E图经过Image J 1.43软件对条带进行灰度值分析后的结果；G为Immunoblotting检测加入不同条件的辅 助因子后CYP2A13蛋白表达差异，H为G图经过Image J 1. 43软件对条带进行灰度值分析 后的结果。图2.不同条件辅助因子对CYP2A13活性的影响，其中A为加入不同条件的辅助因 子后所表达的CYP2A13的特征吸收峰图；B为使用Sata 7. 0软件对CYP2A13蛋白活性进行 的统计分析图。图3.不同条件辅助因子对POR活性的影响，其中A为加入不同浓度5-ALA后POR 蛋白的活性；B为加入不同浓度的Fe3+后POR蛋白的活性；C为加入不同浓度的Hemin后POR 蛋白的活性；D为加入不同种类的辅助因子后POR蛋白的活性差异。图4.不同病毒效价比例对CYP2A13与POR共表达的影响，其中A为加入不同 Ac-Bacmid-CYP2A13病毒效价(Μ0Ι，pfu/cell)后CYP2A13蛋白的表达；B为加入不同 Ac-Bacmid-P0R病毒效价(MOI，pfu/ce 11)后POR蛋白的表达；C为加入不同效价比例的 Ac-Bacmid-CYP2A 13和Ac-Bacmid-POR病毒后CYP2A13蛋白的表达；D为加入不同效价比例的Ac-Bacmid-CYP2A 13和Ac-Bacmid-POR病毒后POR蛋白的活性变化。
具体实施例方式实施例1
1、重组转移载体pFastBacl-CYP2A13质粒的构建与鉴定
pFastBacl-CYP2A13为本实验室保存。经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组 质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA。使用双酶切消化验证 pFastBacl-CYP2A13。2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid_CYP2A13 DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBacl-CYP 2A13重组质粒转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，在 DHlOBac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYP2A13的基因片段 插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重 组 Ac-Bacmid-CYP2A 13 DNA,用 PCR 反应进行验证。3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13的获得
在6孔板接种9 X IO5个细胞/孔，27°C贴壁lh。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂 复合物对细胞进行转染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液(含青霉素IOOu/ ml;链霉素100 yg/ml)，27°C孵育72h或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目的基 因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备 用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。4、重组CYP 2A13蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的CYP2A13蛋 白。感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分 装后-80°C保存备用。以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳， 以免疫印迹法检测CYP2A13蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1. 43软件对条带进行灰度值分析。其中步骤4中辅助因子为0. 5-6 μ g/ml Hemin0实施例2
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。实施例3
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0. 01-0. 4mM Fe3+不同夕卜，其他皆相同。实施例4
与实施例1相比除了步骤4中辅助因子为0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合 物不同外，其他皆相同。实施例5
将实施例1-4所生成的重组CYP 2A13蛋白，利用CO-差示光谱法检测CYP2A13蛋白活
性
采用CO差示光谱法检测CYP2A13蛋白酶活性微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀 释至lmg/ml，取Iml加入到Icm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混 勻后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混勻使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒 体蛋白中CYP450蛋白的含量。结果CYP2A13体外表达及活性的条件优化
为了增强昆虫细胞-杆状病毒表达系统用于表达CYP450S的实用性，我们在进行 CYP2A13蛋白的表达时加入了 Hemin、5-ALA和/或Fe3+，观察不同条件辅助因子对蛋白表达 水平和活性的影响。图1所示，CYP2A13蛋白在45kD左右有条带，说明蛋白在Bac-to-Bac系统中成功 表达(A，C，E，G)。经灰度值扫描分析，在加入 1μ g/ml Hemin,0. 2mM 5-ALA 或 0· 02 mM Fe3+ 时，CYP2A13蛋白表达量比其他浓度各辅助因子高(B，D，F)。对于单独加入0. 2mM 5-ALA或 0. 02 mM Fe3+，同时加入 0. 2mM 5-ALA 和 0. 02mM Fe3+ 时，CYP2A13 蛋白的表达最高(图 H)。此外，研究了不同辅助因子对CYP2A13活性的影响。结果同样发现，同时加入 0. 2mM 5-ALA和0. 02mM Fe3+时，CYP2A13蛋白的活性也明显高于其他单独给予的辅助因子 (图 2)。实施例6
1、重组转移载体pFastBacl- POR质粒的构建与鉴定
双酶消化重组质粒pcDNA3. l(+)/P0R和转移质粒载体pFastBac 1，经1%琼脂糖凝胶 电泳分离后，回收目的片段。用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段， 构建重组转移载体质粒pFastBacl-POR。经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含重组质粒的大 肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA。使用双酶切消化验证pFastBac 1-P0R。2、重组真核表达病毒Ac-Bacmid- POR DNA的构建与鉴定
将已构建好的pFastBacl- POR重组质粒转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，在 DHlOBac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各POR的基因片段插 入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重组 Ac-Bacmid- POR DNA，用PCR反应进行验证。3、重组真核表达病毒Ac-Bacmid- POR的获得
在6孔板接种9 X IO5个细胞/孔，27°C贴壁lh。现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂 复合物对细胞进行转染，27°C孵育5h后，加入2ml Sf-900 II SFM培养液(含青霉素IOOu/ ml;链霉素100 118/1111)，271孵育7211或直到看到病毒感染的迹象为止。收取含有目的基 因的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备 用或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液。4、重组POR蛋白的表达
使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入不同条件的辅助因子，以表达有活性的POR蛋白。 感染后72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装 后-80°C保存备用。其中步骤4中辅助因子为0. 5-6 μ g/ml Hemin0实施例7
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0. 05-0. 6mM 5-ALA不同外，其他皆相同。实施例8
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0.01-0. 4mM Fe3+不同夕卜，其他皆相同。
8
实施例9
与实施例6相比除了步骤4中辅助因子为0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合 物不同外，其他皆相同。实施例10
将实施例6-9所生成的重组POR蛋白，利用细胞色素C分析法检测POR蛋白活力 在Icm光径的比色皿中加入0. 84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0. Iml 0. 8 mM细 胞色素C，再加入20μ1稀释适当倍数的微粒体悬液，混勻后测定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3 分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。结果P0R蛋白表达及活性的条件优化
比较了不同浓度的Hemin、5-ALA、Fe3+对POR表达活性的影响，如图3所示，在加入 0. 5 μ g/ml Hemin,0. 2mM 5-ALA或0. 02 mM Fe3+时，POR蛋白表达活性比其他浓度各辅助 因子高(图3. A，B，C)。相对单独加入0. 2mM 5-ALA或0. 02 mM Fe3+，同时加入0. 2mM 5-ALA 和0. 02mM Fe3+时，POR蛋白的表达活性最高(图3. D)。实施例11
将实施例1步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13，在辅助因子为 0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物时，通过加入MOI为1-5 pfu/细胞，按实施例 1步骤4的方法表达CYP2A13蛋白，并运用免疫印迹法进行鉴定。实施例12
将实施例6步骤1-3获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmi d-POR，在辅助因子为 0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物时，通过加入MOI为1-6 pfu/细胞，按实施例 6步骤4的方法表达POR蛋白，并运用免疫印迹法进行鉴定。实施例13
在辅助因子为0. 05-0. 6mM -ALA和0. 01-0. 4mM Fe3+混合物时，将实施例1步骤1-3 获得的重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYP 2A13和实施例6步骤1_3获得的重组真核表达 病毒Ac-Bacmid-POR，按照CYP2A13-M0I和POR-MOI的比例为5/0-5/6进行配比，按实施例 1步骤4的方法联合表达CYP2A13蛋白和POR蛋白。运用免疫印迹法进行鉴定CYP2A13蛋 白，运用实施例10的方法测定POR蛋白活力。结果CYP2A13和POR蛋白共表达的条件优化
在直径为15cm的平皿中接种3X IO7/皿的Sf9细胞，待细胞贴壁后分别加入不同MOI 的CYP2A13和POR病毒，加入0. 02mM Fe3+禾口 0. 2mM 5-ALA，27 °C培养，以表达有活性的 CYP450蛋白和POR蛋白。图4A和B所示，经免疫印迹检测，发现在分子量72 kD和45 kD位置显示有目的 蛋白表达，当CYP2A13 MOI为5pfu/细胞、POR MOI为2 pfu/细胞时，CYP2A13和POR蛋白 表达最高。选择CYP2A13 MOI为5pfu/细胞，用不同MOI的POR病毒在Sf9细胞中共表达 CYP2A13和POR蛋白。结果显示不同MOI的POR病毒对CYP2A13蛋白表达未有影响(图4. C)。虽然POR活性在相同条件下较单独表达的要低，但随着共表达中POR的MOI的升高出 现递增趋势，在MOI为6pfu/细胞时，已基本达到了较高水平，完全可满足体外代谢活性分 析的要求(图4. D)。
权利要求
1.一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助 因子为如下任意一种① 0. 5-6 μ g/ml Hemin ；② 0. 05-0. 6mM 5-ALA ；③ 0. 01-0. 4mM Fe3+ ； ④ 0. 05-0. 6mM -ALA 和 0. 01-0. 4mM Fe3+ 混合物；具体制备方法如下A、重组转移载体pFastBacl-CYPs/POR质粒的构建与鉴定双酶消化重组质粒pcDNA3. 1 (+) /POR和转移质粒载体pFastBac 1，经1%琼脂糖 凝胶电泳分离后，回收目的片段；用T4 DNA连接酶连接回收的POR基因与载体pFastBac 1片段，构建重组转移载体质粒PFastBacl-POR ；经氨苄青霉素抗性平板筛选，获得含 重组质粒的大肠杆菌，提取菌液DNA，获得重组转移载体质粒DNA ；使用双酶切消化验证 pFastBacl-CYP2A13 禾口 pFastBacl-POR ；B、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/PORDNA的构建与鉴定将已构建好的pFastBac 1-CYPs/POR重组质粒转化DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，在 DHlOBac大肠杆菌的助手质粒Helper辅助下经Tn7转座子转座，将各CYPs/POR的基因片段 插入穿梭载体Bacmid中，经卡那霉素、庆大霉素和四环素三抗筛选和蓝白斑筛选，得到重 组 Ac-Bacmid-CYPs/POR DNA，用 PCR 反应进行验证；C、重组真核表达病毒Ac-Bacmid-CYPs/P0R的获得在6孔板接种9 X IO5个细胞/孔，27°C贴壁Ih ；现配杆粒DNA与Cellfectin转染试剂 复合物对细胞进行转染，27°C孵育证后，加入anl Sf-900 II SFM培养液含青霉素100 IU/ ml ；链霉素100 μ g/ml，27°C孵育7 或直到看到病毒感染的迹象为止；收取含有目的基因 的第一代重组病毒液，再用此病毒液感染Sf9细胞，收取第二代重组病毒液，可以保存备用 或感染Sf9细胞以得到更高效价的病毒液；D、重组CYP450s/P0R蛋白的表达使用重组病毒液感染Sf9细胞，加入辅助因子，以表达有活性的CYP450蛋白；感染后 72小时收集细胞，超声破碎细胞，然后差速离心分离出细胞中的微粒体蛋白，分装后-80°C 保存备用；以空载体病毒感染细胞表达的蛋白做阴性对照，进行SDS-PAGE电泳，以免疫印 迹法检测CYP2A13和POR蛋白的表达，使用扫描仪扫描Immunoblotting条带，用Image J 1. 43软件对条带进行灰度值分析；E、CO-差示光谱法检测CYP450蛋白活性采用CO差示光谱法检测CYP450蛋白酶活性微粒体悬液用微粒体蛋白稀释缓冲液稀 释至lmg/ml，取Iml加入到Icm光径的比色皿中，然后加入适量的保险粉，用封口膜封口混 勻后测定blank，缓慢通入CO 2分钟，混勻使CO与微粒体充分接触，然后在紫外分光光度计 的wavelength scan模式下扫描400nm至550nm处的吸收光谱，再依据相关公式计算微粒 体蛋白中CYP450蛋白的含量；F、细胞色素C分析法检测POR蛋白活力在Icm光径的比色皿中加入0. 84ml的还原酶分析缓冲液，然后加入0. Iml 0. 8 mM细 胞色素C，再加入20μ1稀释适当倍数的微粒体悬液，混勻后测定blank，然后加入50μ1 4mM 的NADPH，用封口膜封口后，迅速混勻，立即用紫外分光光度计的kinetic/time模式检测3 分钟内550nm处的吸光值变化，再依据公式计算还原酶活力。
2.根据权利要求1所述的一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于步骤D所述的辅助因子为0. 2 mM 5-ALA与0. 02mM Fe3+混合物。
全文摘要
本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤D所述的辅助因子为如下任意一种①0.5-6μg/mlHemin；②0.05-0.6mM5-ALA；③0.01-0.4mMFe3+；④0.05-0.6mM-ALA和0.01-0.4mMFe3+混合物，首次对CYP蛋白、POR蛋白及其共表达的条件进行了系统优化，结果发现同时给予0.02mMFe3+和0.2mM5-ALA处理细胞，上述蛋白表达水平及其活性最高。CYP的MOI为5pfu/细胞、POR的MOI为2pfu/细胞时，两者的共表达效率最高。
文档编号C12Q1/26GK102094000SQ20101058835
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者王守林, 陆慧媛 申请人:南京医科大学