专利名称：带随机序列的茎环引物筛选微小rna的表达差异的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别 是涉及荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)。通过在茎环引物3’端引入8个随机核苷酸序列 可以一次性逆转录所有的微小RNA(Hiicr0RNAs)，提高了 microRNAs检测的效率。采用通用 引物的设计可以避免短片段核苷酸难以检测的缺点，达到对microRNAs进行相对定量的目 的。优化实验条件后，构建简单、准确的microRNAs筛选和microRNAs相对定量的检测试剂盒。
背景技术：
microRNAs是机体对mRNA翻译成蛋白质的调节机制之一，成熟的microRNAs具有 这种调节功能。microRNAs在细胞发育、肿瘤的发生、疾病进展等重要的生理、病理过程发挥 了重要的作用。不同个体中microRNAs表达谱也不同，表现为个体差异，可影响药物治疗效 果。microRNAs表达在个体的发育、肿瘤发生、疾病进展等生理、病理过程中发挥了重要作 用。microRNAs的检测有可能成为诊断、治疗和预后判断的靶分子，在肿瘤、老年病、免疫性 疾病等常见疾病的病理过程和分子机制中有突出的研究价值。组织、细胞microRNAs的表达谱和差异表达检测是研究microRNAs的基础技术。通 过对肿瘤和正常细胞的检测可以发现显著的microRNA表达差异，而分离出发挥重要作用 的靶microRNAs才能对肿瘤的发生、发展、预后进行深入的研究。目前，在胰腺癌的研究中 发现 miR-21、miR-let7e、miR-199a、miR-31、miR-30、miR-96、miR-29b 等与正常胰腺组织表 达差异显著，进一步的功能研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。但是成 熟microRNAs仅有21-23个碱基片段，很难采用常规的核酸扩增技术进行表达差异分析和定量检测。通过芯片 技术可以区分大量的microRNAs表达差异，但是需要大量的标本提取RNA。Q-PCR技术可以 定量检测低拷贝的核酸片段，但是需要合成大量的茎环引物对每个microRNA进行逆转录， 使其在表达差异研究上不能最大程度的发挥效用。目前，还未开发出准确、快速、简单、费用低廉的microRNAs筛选技术和定量检测 技术用于各种对microRNAs的研究。本发明基于Q-PCR技术，通过茎环引物3’端引入8个 随机核苷酸，可以逆转录所有的成熟microRNA，并通过多条通用引物配套进行Q-PCR分析， 对microRNAs进行差异表达的筛选并可进行相对定量的检测，解决目前microRNAs分析的 技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是克服现有分子诊断技术中对microRNAs差异表达分析耗时长、不 能高通量、对标本要求高等缺陷，提供了一种茎环引物在3’端引入8个随机核苷酸，可以逆 转录所有的成熟microRNA，并通过多条通用引物配套进行Q-PCR分析，对microRNAs进行 差异表达的筛选并可进行相对定量的检测。提高microRNAs筛选和检测技术的效率和成功率。茎环引物包括来源于水稻序列的SEQ ID NO. 1，其3’端含有8个随机核苷酸序列。茎 环引物内包含多个通用引物位置包括SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。本发明第二个目的是提供一种配套此引物进行microRNAs筛选和定量检测的特 定的逆转录程序和PCR反应程序，达到快速分析的目的。逆转录程序为冰上放置5min， 5°C 5min, 10°C IOmin, 15°C 15min，30°C 30min，95°C 5min。cDNA 扩增程序如下95°C预变性 3min后，进行40-50个循环的95°C变性5sec，62°C退火延伸35sec (此步骤采集荧光值)；本发明第三个目的是提供一种用于microRNAs差异性表达筛查和microRNAs相 对定量检测的试剂盒。试剂盒包括试剂A :3’端带8个随机核酸序列的茎环引物；试剂B M-MuLV逆转录酶；试剂C :5X逆转录缓冲液；试剂D 通用引物A ；试剂E 通用引物B ；试剂 F 通用引物C ；试剂G =Taq DNA聚合酶；试剂H :2XPCR缓冲液组成。本发明的技术方案概述如下一套用于对微小RNA(microRNAs)核苷酸片段进行表达差异分析或进行相对定量 检测的引物。一条3’端引入8个随机核苷酸的茎环引物SEQ ID N0.1针对所有成熟的 microRNAs，用于进行逆转录。此茎环引物内包含3个配套的通用引物序列SEQ ID N0. 2、 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4，用于定量 PCR 检测。一种对微小RNA(microRNA)差异表达筛选和进行相对定量的一套试剂盒，由下述 试剂组成试剂Α:5μΜ 3’端带8个随机核酸序列的茎环引物，50μ L ；试剂B :20U/ μ L M-MuLV 逆转录酶，50 μ L ；试剂C :5Χ逆转录缓冲液，200 μ L含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，Tris-HCl 浓度为 250mM，KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM，50nM DTT。试剂D :2μΜ通用引物A ImL ；试剂E :2μΜ通用引物B ImL ；
试剂F:2yM通用引物C ImL;试剂G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶；试剂H :2XPCR 缓冲液组成，包含 600nM R0X、1 XSYBR Green I dye、 2mMdNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4。逆转录程序为冰上放置5min，5°C 5min, 10 °C IOmin, 15 °C 15min，30°C 30min, 95°C 5min。cDNA扩增程序如下95°C预变性3min后，进行40-50个循环的95°C变性5sec， 62°C退火延伸35sec (此步骤采集荧光值)；本发明优点考虑到microRNA大约有800多种，而且目前通过Q-PCR筛选microRNAs需要分别 进行逆转录获得cDNA后才能进行后续实验，使microRNAs筛选工作耗时长、成本高。通过 引物3’端引入8个随机核苷酸的茎环引物可以一次性逆转录所有成熟的microRNAs，而且 茎环内多个引物位点可在随后定量PCR扩增中能更好的与对侧microRNAs特异性引物相匹 配，避免非特异性扩增和引物二聚体。使整个microRNAs差异表达的筛选更为简单，由于3 个通用引物的灵活搭配，可以更好的选择microRNAs特异性引物使检测更为特异。通过优 化实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为microRNAs研究提供可靠的检测技术。
图1为miR的筛选效果。图2为miR-155的检测效果。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1一种对microRNAs进行表达差异进行筛选的试剂盒，试剂A :5 μ M 3’端带8个随 机核酸序列的茎环引物，50 μ L ；试剂B :20υ/μ L M-MuLV逆转录酶，50 μ L ；试剂C :5Χ逆 转录缓冲液，200 μ L 含 dNTP 浓度为 5mM(包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl 浓度为 250mM,KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM, 50nM DTT ；试剂 D :2 μ M 通用引物 A ImL ；试剂 E :2 μ M通用引物B ImL ；试剂F :2 μ M通用引物C ImL ；试剂G :5U/μ L Taq DNA聚合酶；试 剂H :2XPCR缓冲液组成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括dATP、 dCTP、dGTP、dTTP)，80mM Tris-HCl,80mM KCl，40mM(NH4)2SO4，6mM MgS04。实施例2一种配套此方法检测microRNAs的逆转录操作程序。20 μ L体系中含 2 μ LmRNA (0. 5pg_l μ g)，3’端带8个随机核酸序列的茎环引物2 μ L (终浓度为500ηΜ)，逆转 录缓冲液4 μ L(终浓度dNTP为ImM，M-MuLV逆转录酶浓度为40U，Tris-HCl浓度为50mM， KCl浓度为50mM，MgCl2浓度为4mM)。逆转录程序为冰上放置5min，5°C 5min, 10°C IOmin, 15°C 15min,30°C 30min,95°C 5min。逆转录完成后，试管内加入180 μ L水，进行10倍的稀 释。实施例3 一种配套此方法检测microRNAs的Q-PCR的操作程序。在96孔板的筛选程序中， 每孔体系为10 μ L。在10 μ L Q-PCR体系中，首先加入IyL稀释后的cDNA和IyL microRNA 特异性引物(适应于各种microRNAs，终浓度200nM)。其他试剂混合后共同加入，其中通用 引物A 10(^1^(终浓度2001^，根据情况可选8、0，0-卩0 500 μ L缓冲液(终浓度为300ηΜ R0X,ο. 5 X SYBR Green I dye, ImMdNTPs, 40mM Tris_HCl、40mM KCl, 20mm(NH4)2SO4, 3mm MgSO4)，Taq酶10 μ L (终浓度0. 05U/ μ L)，加入水290 μ L。混勻试剂后，每孔加入8 μ L混 合试剂，盖上盖子或贴膜后在ABI 7500上进行检测。对cDNA扩增及定量程序如下95°C预 变性3min后；进行40-50个循环的95°C变性5sec，62°C退火延伸35sec (此步骤采集荧光 值)。通过常规方法对各PCR管的Ct值进行统计分析，经与内对照进行比较后得出结果。
权利要求
1.一种用于微小RNA(Hiicr0RNA)筛选和相对定量的茎环引物。其特征是一条3’端带 8个随机核酸序列的茎环引物SEQ ID NO. 1，可用于一次性逆转录所有microRNAs，通过荧光 定量核酸扩增技术(Q-PCR)用于microRNA的表达差异分析和相对定量，茎环引物内包含多 个高质量的引物位置用于Q-PCR包括SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4。
2.根据权利要求1所述的用于微小RNA(microRNA)差异表达筛选和相对定量检测，对 microRNA进行分析的PCR反应程序，其特征在于设定特定的PCR反应温度和时间，达到快速 分析和结果特异的目的。
3.根据权利要求1所述的对微小RNA(microRNA)差异表达筛选和相对定量的一套试剂 盒，其特征包括1，由下述试剂组成试剂A :5 μ M 3，端带8个随机核酸序列的茎环引物，50 μ L ； 试剂 B :20U/ μ L M-MuLV 逆转录酶，50 μ L ；试剂C :5Χ逆转录缓冲液，200 μ L含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 浓度为 250mM，KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM，50nM DTT。 试剂D :2 μ M通用引物A ImL ； 试剂E :2 μ M通用引物B ImL ； 试剂F :2 μ M通用引物C ImL ； 试剂G :5U/ μ L Taq DNA聚合酶；试剂 H :2XPCR 缓冲液组成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye，2mMdNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO40
全文摘要
本发明公开了带随机序列的茎环引物筛选微小RNA的表达差异,可用于对微小RNA(microRNAs)核苷酸片段进行表达差异分析和进行相对定量检测的一条带随机片段的茎环引物及多个配套的通用引物、反应程序和试剂盒。试剂盒包括试剂A3’端带8个随机核酸序列的茎环引物；试剂BM-MuLV逆转录酶；试剂C5×逆转录缓冲液；试剂D通用引物A；试剂E通用引物B；试剂F通用引物C；试剂GTaq DNA聚合酶；试剂H2×PCR缓冲液组成。本发明所提供的整套试剂盒可对组织、细胞等多种标本进行microRNAs差异性表达进行分析，同时也可用于microRNAs的相对定量分析。
文档编号C12Q1/68GK102108403SQ20101058774
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月3日 优先权日2010年12月3日
发明者陈必成 申请人:陈必成