专利名称：一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其作为饲料添加剂的应用。
背景技术：
目前因滥用抗生素导致的畜禽产品药物残留超标、耐药致病菌株的大量增加等问 题已引起人们的高度重视。从2006年1月1日起，欧盟全面禁止饲料中使用抗生素促生长 饲料添加剂。最后四种允许做为促生长用途的抗生素饲料添加剂——黄霉素、效霉素、盐霉 素和莫能霉素也停止使用。面对竞争日益激烈的国际市场，抗生素等残留问题一直是限制 我国畜产品出口的瓶颈。所以，寻找饲用抗生素替代品迫在眉睫。抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢产物转变为结构性的次生代谢产 物，诸如短杆菌肽等通过酶促反应把氨基酸转变为结构复杂的化合物。而Msin (乳酸链球 菌素)等细菌素则需要通过核糖体来合成，从而是真正的蛋白类物质。细菌素与抗生素的 根本差别是大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，且具有无毒、无副作用、无残 留、无耐药性，同时也不污染环境等优点。因此，高效安全的饲料添加剂——细菌素的使用 可以在部分情况下减少甚至取代抗生素的使用。使用微生态制剂解决饲用抗生素问题，已经从机理上得到证明有益微生物在其 生长代谢过程中，会产生多种抑菌物质，主要包括芽孢杆菌类产生的抗菌肽、乳酸菌类生成 的细菌素等。有益菌通过这些物质一方面抑制如大肠杆菌、沙门氏菌等的生长，另一方面为 自身的活化、定植提供有利条件。目前，饲料添加剂中，使用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢 杆菌、东洋芽孢杆菌等，芽孢杆菌具有以下优点和特点①具有耐高温、耐酸碱、耐压等特 点，能够耐受颗粒饲料加工的影响；②在贮藏过程中以孢子形式存在，不消耗饲料的营养成 分，可以保证饲料的质量；③进入肠道后，在肠道迅速复活，复活率接近100% ；④芽孢杆菌 能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸；⑤芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠 道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；⑥具有平衡和稳定乳酸杆菌的作 用。由于枯草芽孢杆菌所产的枯草菌素具有抑制一些革兰氏阳性菌，不产生耐药性， 无残留，不污染环境等优点，可以推断，枯草芽孢杆菌代谢产物若能用于饲料添加剂，替代 饲料中的饲用抗生素，必将为饲料微生物添加剂的应用提供广阔的前景。因此，枯草芽孢杆 菌代谢产物作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大，市场前景广阔。目前，现有的枯草芽孢杆菌存在以下缺陷具有抑菌活性的代谢产物的产量不高， 抑菌能力一般，急需抑菌活性较高的枯草芽孢杆菌菌种。
发明内容
针对上述现有技术，本发明旨在筛选抑菌活性高的枯草芽孢杆菌菌株，并对其代 谢产物活性最高的发酵工艺条件、抑菌谱进行研究，并试验其在动物上的应用效果，为今后的工业化开发奠定基础。本发明是通过以下技术方案实现的一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。所述枯草芽孢杆菌的菌种生物学特性如下该菌种的细胞大小为通常为 (0. 7 μ m 0. 8 μ m) X O. 0 μ m 3. 0 μ m)，杆状，很少成链，染色均勻，无荚膜，鞭毛侧生，能 运动；芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏生，大小为0.8 μ mX (1.5μπι 1.8μπι)；游离孢子表 面着色弱；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色 或褐色；革兰氏阳性，接触酶阳性，能发生V-P反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露 醇产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生长温度最高值45 55°C，最低值5 20°C， 最适温度为37°C。所述枯草芽孢杆菌，通过SDSS-PCR鉴定，其代谢产物中主要抑菌物质为分子量在 7000 8000d的小分子物质。所述枯草芽孢杆菌经过安全性试验和效率性试验，结果表明枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilisB7348, CCTCC M 2010260 可以做为饲料添加剂。所述枯草芽孢杆菌做为饲料添加剂应用时，以菌粉的形式添加到饲料中，所述菌 粉是通过以下步骤得到的⑴菌种选用枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis B7348, CCTCC M 2010260 ；(ii)斜面培养将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在32 40°C培养20 28h ；(iii) 一级种子培养取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL IOOmL种子 液体培养基中，在32 40°C条件下，静置培养14 18h，制得一级种子液；(iv)扩大培养以5%的接种量，将一级种子液接于500mL IOOOmL种子液体培 养基中，在32 40°C条件下，静置培养10 16h，制得二级种子液；(ν)发酵罐培养以5%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于32 40°C条件下，静置培养16 Mh ；(vi)收集发酵产物待步骤(ν)之发酵液黏度达12000 15000cP时，收集发酵 液；(vii)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2 3遍后冷冻干 燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；上述步骤(iii)、(iv)中所述种子液体培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨IOg/ L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至6. 5 7. 5，115°C条件下灭菌20min ；步骤(ii)中所述 固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1. 5 2. 0%的琼脂粉；步骤(ν)中所述液 体发酵培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节 pH 至 6. 5 7. 5。鉴于枯草芽孢杆菌B7348对革兰氏阳性菌抑制效果较好，而植物乳杆菌LP-Il (该 菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物 保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150，记载在中国专利申请CN201010M0725.X中)
5对革兰氏阴性菌抑制效果明显，同时，两者的代谢产物具有较强的抑菌作用，两菌种间有着 很好的互补关系，联合使用效果更佳。综合考虑两株菌不同的抑菌效果，将枯草芽孢杆菌 B7348和植物乳杆菌LP-Il及其代谢产物进行复配(其中枯草芽孢杆菌B7348菌粉活菌数 为2.0X108cfu/g，乳酸菌菌粉活菌数为1.0X108cfU/g)，进行合理搭配，形成产品肽菌素， 以满足不同动物、不同养殖阶段的需求。所述的肽菌素的使用剂量如下对正常不患病的种禽，用量为饲料总质量的 0. 2% ；对患病的种禽，用量为饲料总质量的0. 4% ；对妊娠母猪，用量为饲料总质量的0. 1 0. 2% ；对哺乳母猪，用量为饲料总质量的0. 3 0. 4% ；对患有乳房炎的奶牛，用量为80 120g/头/天，可以先用120g/头/天，半个月，再用80g/头/天，半个月，使体细胞(一般 以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值，超过该值为阳性，低于该值则正 常)逐渐控制在20万个以下；对患有阴性乳房炎的奶牛，用量为40g/头/天，长期使用即 可，1个月后体细胞逐渐被控制在20万个以下。
本发明提供的具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌命名为Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。图1为枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌Nxc6对不同指示菌的抑菌效果图，其 中，A为B7348对鸡大肠杆菌078的抑菌效果图，B为B7348对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 图，C为B7348对猪大肠杆菌2116的抑菌效果图，D为Nxc6对鸡白痢沙门氏菌C79-13的抑 菌效果图。图2为枯草芽孢杆菌B7348 SDS-PAGE分析。图3为安全性试验增重率数据图。图4为试验各组肉鸡的饲料转化率。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1产抑菌物质芽孢杆菌的筛选一、芽孢杆菌初筛芽孢杆菌在动物体内定殖能产生大量淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和植酸酶等。这些 酶在动物肠道内，有助于直接分解、消化饲料营养成分，降解植物性饲料中的非淀粉多糖， 改善消化道食糜的物理特性或消除日粮中的抗营养因子，促进动物的生长和生产。另外，芽 孢杆菌产生了大量的代谢产物，也包括细菌素，例如枯草菌素(subtilin)等。细菌素具有 直接的抑菌活性，通过与其它代谢产物如乙酸、丙酸、丁酸等共同作用，可有效抑制病原菌 生长，提高动物的免疫水平，最终提高了饲料的转化率。1.材料与方法1. 1试验菌株枯草芽孢杆菌N9、枯草芽孢杆菌N9-1-35、地衣芽孢杆菌S、冷水菌 1#、纳豆芽孢杆菌1#、短小芽孢杆菌BT123、纳豆芽孢杆菌4#、蜡样芽孢杆菌等。1. 11发酵培养基及培养条件葡萄糖1.5%，黄豆饼粉3.0%，蛋白胨0.2%，NaCl0.1%, (NH4)2SO4 0. 5%, CaCO3 0. 6%, MgSO4 0. 6%, pH 7. 2 7. 5，37°C液态培养 48h。1. 1. 2试验菌株前处理将斜面菌种接种到装有IOOmL发酵培养基的500mL三角瓶 中，37°C恒温振荡(ISOrpm)培养至芽孢率10%以上，5000rpm离心分离菌体和上清液，取上 清液备用。1. 2指示菌猪大肠杆菌1565、藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌。培养基及培养条件葡萄糖0.2%，蛋白胨1.0%，NaCl 0. 5%，牛肉膏0. 5%，pH 7. 0，37°C液态培养24h。以上培养所得指示菌试验前均稀释100倍，OD值0. 2 0. 3之间。1. 3体外抑菌试验-管碟法双碟的制备取直径90mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂(1. 5% ) 15mL，水平放置 使之凝固，作为底层，另取指示菌培养基(浓度为0.8%，冷至50°C左右)与指示菌菌液适 量混勻，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。加样品用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中 加满相同量的抗菌液(300 μ L)，每个样品三个重复。将加完样的培养皿小心放入37°C恒温 箱内，培养1 后取出测量抑菌圈直径。
1. 4主要仪器设备
XSS-600显微镜
山东光电仪器厂
500型恒温培养箱 JHT型净化作台 LD5-2A型离心机 PHS-3C型精密pH计 BC-163K型冰箱 GUJS-7A型实验发酵罐 TCYQ型恒温振荡器 LD4-40型离心机 FAl 004型电子天平
山东潍坊医疗器械厂 济南空气净化消毒设备厂 北京医用离心机厂 上海精密科学仪器有限公司 青岛海尔电冰箱有限公司 镇江东方生物工程设备公司 太仓市实验设备厂 北京医用离心机厂 上海天平仪器厂
权利要求
1.一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株命名为Bacillus subtilisB7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCCM 2010260。
2.根据权利要求1所述的具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于所 述枯草芽孢杆菌的菌种生物学特性如下该菌种的细胞大小为通常为(0.7μπι 0. 8 μ m) X O. 0 μ m 3. 0 μ m)，杆状，很少成链，染色均勻，无荚膜，鞭毛侧生，能运动；芽孢 呈椭圆形或柱状，中生或偏生，大小为0. 8 μ mX (1. 5 μ m 1. 8 μ m)；游离孢子表面着色弱； 培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色；革 兰氏阳性，接触酶阳性，能发生V-P反应；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，能 水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生长温度最高值45 55°C，最低值5 20°C，最适温度为 37 °C。
3.权利要求1所述的具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于应用时，以菌粉的形式添加到饲料中，所 述菌粉是通过以下步骤得到的⑴菌种选用枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis B7348, CCTCC M 2010260 ；( )斜面培养将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在32 40°C培养20 ^h ；(iii)一级种子培养取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL IOOmL种子液体 培养基中，在32 40°C条件下，静置培养14 18h，制得一级种子液；(iv)扩大培养以5%的接种量，将一级种子液接于500mL IOOOmL种子液体培养基 中，在32 40°C条件下，静置培养10 16h，制得二级种子液；(ν)发酵罐培养以5%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于32 40°C 条件下，静置培养16 Mh;(vi)收集发酵产物待步骤(ν)之发酵液黏度达12000 15000cP时，收集发酵液；(vii)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2 3遍后冷冻干燥，粉 碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；上述步骤(iii)、(iv)中所述种子液体培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L，酵 母膏5g/L，使用时，调节pH至6. 5 7. 5，115°C条件下灭菌20min ；步骤(ii)中所述固体 斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1. 5 2. 0%的琼脂粉；步骤(ν)中所述液体发 酵培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L，使用时，调节pH 至 6. 5 7. 5。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于应用时，添加植物乳杆菌LP-11，组成产 品肽菌素，作为饲料添加剂加入到饲料中。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述肽菌素中，枯草芽孢杆菌B7348菌粉 的活菌数为2. OX 108cfu/g，植物乳杆菌LP-Il菌粉的活菌数为1. OX 108cfu/g。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述肽菌素作为饲料添加剂的用量如下对正常不患病的种禽，用量为饲料总质量的0. 2% ；对患病的种禽，用量为饲料总质量的0. 4% ；对妊娠母猪，用量为饲料总质量的0. 1 0. 2% ；对哺乳母猪，用量为饲料总质量的0. 3 0. 4% ； 对患有乳房炎的奶牛，用量为80 120g/头/天·’ 对患有阴性乳房炎的奶牛，用量为40g/头/天。
全文摘要
本发明公开了一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus subtilisB7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010260。本发明的枯草芽孢杆菌经过安全性试验和效率性试验，结果表明可以做为饲料添加剂。应用时，以菌粉的形式添加到饲料中，在使用时，将枯草芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP-11及其代谢产物进行复配，进行合理搭配，可以满足不同动物、不同养殖阶段的需求，非常适合现阶段养殖特点和养殖模式。
文档编号C12N1/20GK102120975SQ20101058907
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘虹, 单宝龙, 张志焱, 徐海燕, 杨立华, 王静, 程秀芳, 谷巍, 陈静 申请人:山东宝来利来生物工程股份有限公司