专利名称：一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用。
背景技术：
我国是一个畜牧业大国，也是畜产品消费大国。抗生素在预防或治疗动物感染寄生虫和细菌性疾病中被广泛大量使用，人们已经认识到滥用抗生素的危害，作为动物生长促进剂正在被限制或禁用，抗生素使用造成的药物残留问题已成为畜牧业发展的严重障碍。动物源食品抗生素超标而导致的出口损失以及公共卫生安全问题引起了广泛的关注。人们迫切需要寻找可能的替代品，更希望找到与人类抗生素关联很少的物质进行疾病的预防和治疗，以消除抗生素的耐药性对人类健康的威胁。细菌素无疑是一类天然的具有巨大潜力的抗菌物质，因此细菌素成为了近年来研究的热点。细菌素(Bacteriocins)是某些细菌在代谢过程中,通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，具有高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点。而传统的青霉素等抗生素是由细胞多酶复合体催化形成的代谢产物，不存在结构基因；而细菌素由基因编码，可以通过基因工程的手段加以改造。乳酸链球菌肽Nisin是世界上公认安全的防腐剂，已有52个国家和地区使用Nisin作为食品保鲜剂，从而促进了其它种类细菌素的研究及其在食品防腐剂之外领域的开发和应用。近年来，细菌素因其具有无毒、高效、耐高温、无残留、无抗药性等优点，已被广泛用作食品添加剂和微生态制剂。随着饲料工业的快速发展和规模化的养殖模式上的推广，人们对动物源食品的安全水平更加关注。如果将产细菌素的菌株制备成益生素活菌制剂或开发出细菌素饲料添加剂，以减少抗生素添加剂在饲料中的滥用，那么细菌素在畜牧业中的应用潜能将非常巨大。
发明内容
本发明提供了一株幾肠球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI。本发明提供的幾肠球菌(Enterococcus faecalis) E15-QJI,其保藏号为CGMCCN0. 6130。上述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130 或其发酵产物在制备抑菌和/或杀菌产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种；也可以抑制耐药性鸡伤寒沙门氏菌、耐药性肠炎沙门氏菌、普通变形杆菌或猪链球菌。所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌；所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌CVCC C83707。
上述应用中，所述发酵产物按照包括如下步骤的方法制备将上述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130进行液体发酵，收集产物，即为发酵产物。上述应用中，所述液体发酵的温度为37°C，所述液体发酵的时间为24h，所述液体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基。上述应用中，所述发酵产物制备方法中还包括如下步骤将所述产物在4°C、9100 X g离心lOmin，收集上清液，得到发酵产物。本发明的另一个目的是提供一种抑菌产品。本发明提供的抑菌产品，其活性成分为上述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130或上述应用中的发酵产物；上述抑菌具体为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增 生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种。本发明的第三个目的是提供一种杀菌产品。本发明提供的杀菌产品，其活性成分为上述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130或上述应用中的发酵产物；所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌；所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌CVCC C83707。本发明的第四个目的是提供一种制备抑菌产品或杀菌产品的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将上述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)E15-⑶I CGMCC NO. 6130进行液体发酵，收集产物，即得到抑菌产品或杀菌产品。上述方法中，所述液体发酵的温度为37°C，所述液体发酵的时间为24h，所述液体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基。上述方法还包括如下步骤在所述收集产物后还包括如下步骤将所述产物在4°C、9100Xg离心lOmin，收集上清液，得到抑菌产品；上述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种；所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌；所述杀灭大肠埃希氏菌具体为杀灭大肠埃希氏菌CVCC C83707。菌株E15-⑶I于2012年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 6130，分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。本发明的实验证明，本发明从动物胃肠道快速筛选出粪肠球菌E15-CUI，将该菌株进行发酵培养，发酵产物可以抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、马腺疫链球菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等多种菌，且抑菌效果大于同类的粪肠球菌，经过初步判断抑菌是由于细菌发酵产生了一种具有蛋白性质的细菌素物质引起。因此本发明的菌株及其发酵产物在畜牧业中的应用潜能将非常巨大。
图I为E15-CUI的形态观察图2为E15-CUI培养特性图3为透射电镜观察E15-CUI发酵液对大肠杆菌CVCC C83707形态的影响
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、E15-⑶I的分离及鉴定
1、E15-CUI 的分离(I)动物胃肠道的处理无菌取健康猪的整个消化道包括胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠，分别取各部位黏膜组织lg，置于灭菌的平皿中、剪碎，用5mL的无菌生理盐水制成悬液，取100 u L悬液接种乳酸菌增菌培养基中，置在37°C温箱中烛缸法培养48h，得到增菌培养后的菌液。(2)分离纯化取增菌培养后的菌液在肠球菌选择培养基(购自杭州天和试剂有限公司)上进行划线分离培养，37°C培养24h。挑取典型菌落、镜检，无杂菌进行移植、纯化培养，保存于4°C冰箱中备用。(3)抑菌实验MRS液体培养基胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，蔗糖5g，枸橼酸铵2g，醋酸钠 15g, KH2P046g, MnSO4 4H20MgS04 7H20 0. 58g, 0. 25g, FeSO4 7H20,0. 03g,吐温 _801g，蒸馏水 1000ml, pH7. 0。PYG 培养基大豆蛋白胨 0. 5g，酵母浸粉 0. 5g，KH2PO4O. lg, MgSO4 7H200. 02g,MnSO4 4H20 0. 002g,葡萄糖 0. lg，蒸懼水 100ml, pH6. 5。发酵将上述(2)得到的已分离纯化的细菌接种至MRS液体培养基中，37°C、200r/min振荡发酵培养24h，得到发酵产物；将发酵产物在4°C、9100 X g离心lOmin，取上清液备用；指示菌(见下表I)的培养分别将指示菌培养到对数生长期，用灭菌生理盐水稀释到107CFU/mL，取IOOul涂布PYG培养基平板；采用琼脂打孔双层平板扩散法，加样(上述上清液)后置4°C冰箱中扩散lh，37°C培养24h观察抑菌活性，结果见表I :表I为抑菌试验结果
权利要求
1.粪肠球菌(Enterococcusfaecalis) E15-CUI，其保藏号为 CGMCC NO. 6130。
2.权利要求I 所述的粪肠球菌(Enterococcus faecal is )E15_CUI CGMCC NO. 6130 或其发酵产物在制备抑菌和/或杀菌产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于 所述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种； 所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于 所述发酵产物按照包括如下步骤的方法制备将权利要求I所述的粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130进行液体发酵，收集产物，即为发酵产物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于 所述液体发酵的温度为37°C，所述液体发酵的时间为24h，所述液体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述发酵产物制备方法中还包括如下步骤将所述产物在4°C、9100Xg离心lOmin，收集上清液，得到发酵产物。
7.—种抑菌产品，其活性成分为权利要求I所述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)E15-CUI CGMCC NO. 6130或权利要求2_6中任一所述应用中的发酵产物；所述抑菌具体为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种。
8.一种杀菌产品，其活性成分为权利要求I所述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)E15-CUI CGMCC NO. 6130或权利要求2_6中任一所述应用中的发酵产物；所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌。
9.一种制备抑菌产品或杀菌产品的方法，包括如下步骤将权利要求I所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis) E15-CUI CGMCC NO. 6130进行液体发酵，收集产物，即得到抑菌广品或杀菌广品。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于 所述液体发酵的温度为37°C，所述液体发酵的时间为24h，所述液体发酵的转速为200r/min，所述液体发酵的培养基为MRS液体培养基； 所述方法还包括如下步骤在所述收集产物后还具体包括如下步骤将所述产物在4°C、9100Xg离心lOmin，收集上清液，得到抑菌产品； 所述抑菌为抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌、单核细胞增生李氏杆菌、马腺疫链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌中的至少一种； 所述杀菌为杀灭大肠埃希氏菌。
全文摘要
本发明公开了一株粪肠球菌及其广谱抑菌作用的应用。本发明提供了一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)E15-CUI，其保藏号为CGMCC NO.6130。本发明还提供了所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)E15-CUI CGMCC NO.6130或其发酵产物在制备抑菌产品中的应用。本发明的实验证明，本发明从动物胃肠道快速筛选出粪肠球菌E15-CUI，将该菌株进行发酵培养，发酵产物可以抑制大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、马腺疫链球菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌等多种菌。
文档编号C12N1/20GK102732468SQ201210234030
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者刘凤华, 崔德凤, 张永红, 李焕荣, 阮文科 申请人:北京农学院