一种用于水产养殖的改性低聚壳聚糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖领域，更具体地，本发明设及一种用于水产养殖的改性低聚 壳聚糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是甲壳素脱乙酷基的产物，是碱性多糖，也是少数带电荷的天然产物之一， 具有广谱抑菌、增强机体免疫力、提高动物生产性能、改善动物肉质及净化水质的作用，并 且来源广泛，无毒无害、无残留、无耐药性，安全又高效，是一种极具开发价值的饲料添加 剂。
[0003] 壳聚糖对大肠杆菌、金色葡萄球菌和绿浓杆菌及白色念球菌等多种细菌均有明显 的抑制和杀灭作用，表现出较强的抗菌活性。但与已有的化学合成抗菌剂相比，抗菌活性依 然较低且对真菌类基本上没有抑制活性，另外壳聚糖的抑制作用也因分子量的增大而减 弱，运与壳聚糖分子量越大，水溶性越差有关，从而导致抑菌性减弱。
[0004] 因此目前需要对壳聚糖结构上的C2-N也和C6-OH进行化学改性，来增强制备产物的 溶解性并同时增加抑菌活性中屯、，从而制备一种新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个方面提供了一种用于水产养殖的改性低聚壳聚糖，所述改性低聚 壳聚糖为低聚壳聚糖上至少接枝赃嗦二酬酸和季锭盐。
[0006] 在一种优选的实施方式中，所述改性低聚壳聚糖的重均分子量为3000~50000。
[0007] 在一种优选的实施方式中，所述赃嗦二酬酸与低聚壳聚糖的接枝率为1~5%。
[000引在一种优选的实施方式中，所述赃嗦二酬酸选自
[0009] A:
[0013] 中的一种或两种。
[0014] 在一种优选的实施方式中，所述赃嗦二酬酸A与B摩尔比为(0.3~0.5): 1。
[0015] 在一种优选的实施方式中，所述季锭盐与低聚壳聚糖的接枝率为1~5%。
[0016] 在一种优选的实施方式中，所述季锭盐选自
任意一种或多种，式中，X为Cl、B;r、I中的任意一种;η为2~13中的任意一个整数。
[0021 ] 在一种优选的实施方式中，所述季锭盐C与D、Ε、F之间摩尔比为(0.1~0.2): (0.2 ~0.3):(0.5~0.7):1。
[0022] 在一种优选的实施方式中，所述季锭盐C与D、E、F之间摩尔比为（0.12~0.18): (0.24~0.28):(0.55~0.66):1。
[0023] 本发明的第二个方面提供了一种改性低聚壳聚糖的制备方法，所述方法包括下述 步骤：
[0024] (1)按重量份将重均分子量在3000~50000的低聚壳聚糖浸入2V 2^%醋酸溶液 和2V 5wt%的过氧化氨溶液中；
[0025] (2)将赃嗦二酬酸溶解于10V甲醇中，再加入到所述步骤（1)得到的低聚壳聚糖溶 液中，得到反应液；
[0026] (3)将所述步骤(2)中得到的反应液用lOwt%化0H水溶液调节抑呈中性后过滤，对 截留物经浸泡、洗涂、过滤和干燥；
[0027] (4)将 X-[ciVi^X 分别与
在溶剂乙腊(5V)反应，减压除去溶剂，得到季锭盐；
[0028] (5)将所述步骤（3)合成的低聚壳聚糖赃嗦二酬酷胺分散于丙酬（3V)中，加入 20wt % NaOH水溶液，进行碱化，然后加入季锭盐，进行季锭化反应，最后出料浆；
[0029] (6)将所述步骤(5)制备的料浆调节中性后过滤，对截留物经浸泡、洗涂和干燥后， 得到改性低聚壳聚糖。
[0030] 参考W下详细说明更易于理解本申请的上述W及其他特征、方面和优点。
【具体实施方式】
[0031] 参选W下本发明的优选实施方法的详述W及包括的实施例可更容易地理解本公 开内容。在W下说明书和权利要求书中会提及大量术语，运些术语被定义为具有W下含义。
[0032] 单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。
[0033] "任选的"或者"任选地"是指其后描述的事项或事件可W发生或不发生，而且该描 述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0034] 说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体 数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相 应的，用"大约"、"约"等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似 用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可W 组合和/或互换，如果没有另外说明运些范围包括其间所含有的所有子范围。
[0035] 本申请的第一方面设及用于水产养殖的改性低聚壳聚糖，所述改性低聚壳聚糖分 子结构上至少接枝赃嗦二酬酸和季锭盐。
[0036] 本发明的改性低聚壳聚糖作为抑菌剂的应用，所述的抑菌剂对革兰氏阳性菌（金 黄色葡萄球菌）、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌）、弧菌、嗜水气单胞菌及溫和气单胞菌等多种 细菌及白色念珠菌等真菌具有抑制作用。
[0037] 本申请使用的术语"低聚壳聚糖"是指包含壳聚糖单体单元的聚合物。在一种实施 方式中，壳聚糖单体可W由下式表示
[00；3 引
[0039] 在一种实施方式中，低聚壳聚糖可W由下式表示
[0040]
[0041 ] 其中η约为16~310,在优选的实施方式中，η为16~124。
[0042]壳聚糖具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等多种细菌均有明 显的抑制和杀灭作用。其抗菌作用机理主要分为两类:对于大分子壳聚糖，主要通过高分子 链密集于细菌的表面形成一层高分子膜，影响体外的营养物质向细胞内运输，阻止代谢物 的排泄，使细菌菌体的新陈代谢素乱，从而达到杀菌抑菌的作用;对于小分子壳聚糖，可W 通过渗透作用到达细菌内部，吸附细胞体内带有阴离子的细胞质，并使其发生絮凝、变性， 扰乱细菌的正常生理活动，起到抗菌灭菌的作用。
[0043] 壳聚糖可促进邮类蚁壳生长，增强免疫防御能力。此外，还可W改善水质。使用水 产用低分子量壳聚糖粉对养殖水体中的氨态氮和亚硝酸盐有明显降低作用，且在改善水质 的同时还能抑制水产动物病原菌生长，预防疾病，使罗氏沼邮活力旺盛、体色鲜艳、品质佳。 壳聚糖作为罗非鱼饲料添加剂能在饲料表面形成一层保护膜，从而延长饲料的水化时间W 保护养分;防止霉变，减少对水源的污染。低分子量壳聚糖还可W保护生物体组织细胞膜免 受自由基攻击，间接降低金属硫蛋白在儒胁迫下的应激压力，减轻水生动物受到重金属的 危害。
[0044] 用壳聚糖降解制备的重均分子质量在5000~10000的低分子壳聚糖对细菌和微生 物有一定抑制作用，且运种抑制作用随着质量浓度增加而增强.壳聚糖对不同细菌的抑制 效果随着分子量的变化而变化，壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌作用随分子量减小而逐渐 减弱，对大肠杆菌分子量越小，抗菌作用越明显。有研究发现，壳聚糖具有抑制变链菌生长 的功效，带正电荷的壳聚糖分子与细菌带负电荷的细胞膜作用，使其胞壁受损，壳聚糖易透 过受损的胞壁进入胞核内，与分子结合破坏DNA合成，从而具有抗菌活性。
[0045] 重均分子量的测定：当入射光电磁波通过介质时，使介质中的小粒子(如高分子） 中的电子产生强迫振动，从而产生二次波源向各方向发射与振荡电场(入射光电磁波）同样 频率的散射光波。运种散射波的强弱和小粒子(高分子）中的偶极子数量相关，即和该高分 子的质量或摩尔质量有关。根据上述原理，使用激光光散射仪对高分子稀溶液测定和入射 光呈小角度(2°-7°)散射光强度，从而计算出稀溶液中高分子的绝对重均分子量(MW)值。采 用动态光散射的测定可W测定粒子(高分子)的流体力学半径的分布，进而计算得到高分子 分子量的分布曲线。
[0046] 本申请使用的术语"改性低聚壳聚糖"是指用赃嗦二酬酸改性低聚壳聚糖，再用季 锭盐对改性的低聚壳聚糖进行改性处理得到。
[0047] 本发明旨在把壳聚糖作为先导化合物，对壳聚糖分子进行修饰。为了增强壳聚糖 的杀菌抑菌活性，本发明采取如下两种途径：
[0048] 第一，对壳聚糖分子进行修饰，把具有杀菌抑菌活性的活性基团赃嗦二酬酸接入 壳聚糖分子，使得接入的活性基团与壳聚糖自身的活性相互增效，达到增强杀菌抑菌活性 的目的。
[0049] 第二，增强壳聚糖杀菌抑菌活性。壳聚糖的生物活性源于其C2位活泼的氨基基团， C3和C6位活泼的径基基团，其中杀菌抑菌活性主要与氨基基团有关，氨基的聚阳离子也就是 氨基的正电性起到关键作用。通过对壳聚糖进行修饰，可W改变氨基的正电性强弱，增强壳 聚糖的杀菌抑菌活性，即对改性的低聚壳聚糖接枝季锭盐进一步增强制备产物的溶解性并 同时增加抑菌活性中屯、，从而制备一种新型具有多抗菌活性中屯、的抑菌剂。
[0050] 本发明中赃嗦二酬酸具有杀菌抑菌活性。二酬赃嗦类化合物作为一类生物活性很 强的化合物，其结构和活性具有稳定性、新颖性和独特性等优点，因此在医药、食品及天然 产物开发研究等众多领域中具有广阔的应用前景，因其可作为活性先导化合物，在寻找蛋 白作用受点、药物祀点等方面也扮演重要角色。近年来，人们对二酬赃嗦类化合物的结构、 功能等都开始有了逐步的了解，且从动植物及海洋微生物，尤其是海绵共栖细菌中提取、分 离到的二酬赃嗦类化合物的数量也逐年增加，由于其结构新颖、功能奇特等优点引起众多 学者的重视。
[0051] 二酬赃嗦类化合物的基本结构是由两个氨基酸缩合而成的环二肤，因其骨架具有 稳定的六元环结构，且有两个氨键给体和两个氨键受体，使得DKPs具有较强的生物活性和 药理活性，在药物化学中成为一个重要的药效团。近年来从海洋微