一种桃胶多糖降解产物pgp-2及其制备方法和应用
【专利说明】-种桃胶多糖降解产物PGP-2及其制备方法和应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于桃胶多糖制备技术领域，更具体地，设及一种桃胶多糖降解产物PGP-2 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0003] 桃胶为菩薇科植物桃或山桃树皮中分泌出来的树脂。关于桃胶的药用价值，中医 古籍广有记载。桃胶性平，味甘苦，擅长活血消肿、通淋止痛，止渴、消渴。临床运用对血淋、 石淋、糖尿病等症均有良效。
[0004] 我国桃胶资源丰富，是一种优质的中药资源。国内外均有关于桃胶多糖组成的报 道，但是天然多糖的酶水解一直W来都是世界性难题，高效多糖水解酶菌株的筛选及相关 研究一直备受人们的关注。由于多糖空间构象的位阻作用，单一酶很难将多糖完全解聚。由 于桃胶本身短螺旋结构的保护及侧链所产生的位阻，使得一般的阿拉伯半乳聚糖水解酶如 半乳糖巧酶、阿拉伯糖巧酶和半乳糖醒酸酶等都很难将其降解。本课题组采用前期研究的 成果，采用具有分解桃胶能力的微杆菌A5在桃胶培养基中诱导产酶的方法来水解桃胶多 糖，并进行分离纯化，期望得到一种经过酶解后的产物，能够展现更高的生物学活性，从而 为桃胶多糖的进一步提取和应用提供技术支持。
【发明内容】
[0005] 本发明根据目前桃胶多糖提取技术中的不足，提供了一种桃胶多糖降解产物PGP- 2及其制备方法和应用。
[0006] 本发明的技术目的通过W下技术方案实现： 本发明提供了一种桃胶多糖降解产物PGP-2，所述PGP-2由微杆菌A5接种至桃胶培养基 上获得发酵液，分离纯化获得； 所述微杆菌A5于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号为CCTCC NO :1209174； 所述分离纯化采用阴离子交换进行，洗脱为采用NaCl溶液进行梯度洗脱。
[0007] 优选地，所述化C1溶液的梯度洗脱浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、 0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、l.Omol/X; 所述PGP-2为0.2mol/LNaCl溶液洗脱后的产物。
[000引优选地，所述PGP-2的制备具体包括如下步骤： 51. 将菌种活化，得到种子液； 52. 将S1中所得种子液接种至桃胶培养基，进行发酵培养，S2中发酵溫度为20~40°C， 初始桃胶浓度4~8%，培养基抑为4~6，摇床转速为160~20化pm，得到发酵液； 53. 将S2中所得发酵液进行分离纯化，得到所述PGP-2; 所述S3中包括如下步骤： 531. 将S2中所得发酵液离屯、，得到桃胶多糖液，然后过滤，依次将过滤产物经过脱蛋 白、醇沉、干燥后，得到干燥产物； 532. 将S31中所得干燥产物经过阴离子交换、浓缩、透析、除杂、干燥后即得所述PGP-2。
[0009] 本申请人采用前期研究的成果，在特定酶解条件下，采用具有分解桃胶能力的微 杆菌A5在桃胶培养基中诱导产酶的方法来水解桃胶多糖，并结合分离纯化工艺，提取得到 了桃胶多糖PGP-2。
[0010] 经菌体降解后获得的多糖产物中会有培养基来源的无机盐及醇不溶的小分子等 杂质，W及菌体及菌体分泌的蛋白及其它代谢产物。可按分子大小和形状分级（如分级沉 淀、超滤、分子筛、层析等），也可按分子所带基团的性质分级(如按电荷性质分级的电泳、离 子交换层析等)进而对多糖降解产物进行分离提取。
[0011] 同时，本发明中发现，PGP-2经过DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱的方式可W获 得，但是经过Se地adex G200柱层析和有机溶剂洗脱的分离方式不能将经过发酵后的桃胶 粗多糖产品分离开来。
[0012] 优选地，所述S2中发酵溫度为30°C，初始桃胶浓度8%，培养基pH为4,摇床转速为 160巧m，接种量为3%。
[0013] 优选地，所述S1中菌种活化为将所述菌种在4Γ保存斜面菌种，营养琼脂平板划 线，37 Γ倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试管培养基，于20化pm转速，37 Γ下震荡培 养1化。
[0014] 优选地，所述S31中脱蛋白采用Sevage法脱蛋白，所述S31中醇沉为采用75%的乙 醇； 所述S32中浓缩为采用聚乙二醇8000进行浓缩处理，所述透析为采用截留分子量200的 透析袋。
[0015] 本发明中发酵液的分离纯化步骤如下所示：
[0016] 本发明通过对PGP-2进行相关生物活性研究，发现其对能抑制化la细胞生长及增 殖，且抑制作用随浓度增加而增加，并且能对半乳凝集素 -3所诱导的鸡血红细胞、Hela细 胞、乳腺癌MCF-7细胞的凝集产生抑制作用。还能促进双歧杆菌和枯草芽抱杆菌的增长，抑 审IJ尿肠球菌的增长。此外，PGP-2对径基自由基和DPPH都有较强的清除能力，为天然多糖产 物的实际应用提供了技术支持，具备广泛的应用前景。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果： 本发明的提供的PGP-2制备简单，并能够显著促进双歧杆菌的增长，抑制尿肠球菌的增 长，且具备较强的对径基自由基和DPPH'自由基的清除能力，对Galectin-3介导的细胞聚集 抑制实验表明，其能够显著抑制Galectin-3介导的鸡血红细胞、Hela细胞W及MCF-7细胞的 凝集。
[001引【附图说明】： 图1为实施例2中桃胶粗多糖经过DEAE-52阴离子交换柱NaCl梯度洗脱曲线。
[0019] 图2为PGP-2的红外光谱图。
[0020] 图 3 为PGP-2 的 MALDI-T0F-MS 图。
[0021] 图4为PGP-2和PGP-2对几种肠道菌生长的影响。
[0022] 图5为PGP-2的抗氧化活性影响。
[0023] 图6为PGP-2对化la细胞毒性和细胞生长抑制作用。
[0024] 图7为PGP-2对化la细胞增殖的影响。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对 本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员 可W根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0026] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。
[0027] 实施例1:微杆菌降解桃胶制备发酵液： 1、 菌种活化 4 Γ保存斜面菌种，营养琼脂平板划线，37 Γ倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试 管培养基，6ml/支，200巧m，37 °C，震荡培养12h。
[002引 1.8%的LB液体培养基：3.6g复合LB，去离子水定容至200ml，PH=4，12rC，20分钟 灭菌备用。
[0029] 菌种为微杆菌A5,于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号 为CCTCC N0:M209174; 2、 摇瓶培养 将活化后的种子液接种至桃胶摇瓶培养基中，500mlS角瓶，装液量为200ml，初始桃胶 浓度为8%、初始pH=4，接种量为3%，培养溫度为30°C、160rpm震荡培养2地。培养后的发酵液 用于后续桃胶多糖降解产物的分离。
[0030] 桃胶多糖培养基的制备:准确称取桃胶多糖，去离子水定容到200ml，PH=4。121°C， 15分钟灭菌备用。
[0031] 实施例2:将实施例1所得发酵液进行分离纯化： 先将实施例1制备得到的发酵液与Sevage试剂(氯仿:戊醇或正下醇（W4:l或5:1比例 混合)按一定比例混合，然后离屯、除去介于提取液与Sevage试剂交界处的变性蛋白质，然后 采用75%的乙醇来沉淀上述物质，得到桃胶粗多糖。
[0032] 选用DEAE-Cellulose 52阴离子交换来进一步纯化桃胶粗多糖，具体如下： 取lOg肥AE-5巧日入500ml水，浸泡2地，使纤维素颗粒充分膨胀，去除悬浮的细颗粒。其 后转移到布氏漏斗（内垫200目的尼龙网）中抽滤，用200ml 0.5mol/L化0H-化C1溶液浸泡 地，转移到布氏漏斗（内垫200目的尼龙网）中抽滤，用蒸馈水洗至中性，抽干后转移到烧杯 中，用200ml 0.5mol/L HC1浸泡4h。再转移到布氏漏斗内抽滤，用蒸馈水洗至中性，抽干后 转移至烧杯中，如此酸碱反复轮洗，直至洗出液无色澄清为止。最后用150ml 0.02mol/L，PH =6.5的憐酸缓冲液浸泡20min，脱气后装柱，备用。
[0033] DEAE-Cellulose 52阴离子交换树脂柱的制备:先将1.8X40cm的层析柱垂直架 好，用适量的水溶液先润洗检漏，保持底部有少许水溶液，然后把预先处理好的DEAE-52 揽匀，随即将此悬浊液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端出 口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其 一直浸没在溶剂，严防气泡产生。控制其流速，让200ml