蛋白a洗脱产物中杂质的去除的制作方法
【专利说明】蛋白A洗脱产物中杂质的去除
相关专利申请的交叉引用
[0001]本申请要求基于2014年1月3日提交的第61/923，380号美国临时申请的优先权，该申请作为参考纳入本文用于所有目的。
发明背景
[0002]蛋白A是一个41kD的胞壁蛋白，源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)，结合抗体Fc区的亲和力高。例如，蛋白A结合人IgGl、IgG2和IgG4以及小鼠IgG2a和IgG2b的亲和力高。蛋白A结合人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl的亲和力中等。
[0003]蛋白G是一种免疫球蛋白结合蛋白，在C族和G族链球菌中表达。蛋白G结合的IgG亚类比蛋白A多。蛋白L最早分离自大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)表面，它也结合免疫球蛋白，通过与κ轻链之间的相互作用结合。
[0004]蛋白A/G —种重组融合蛋白，兼有蛋白A和蛋白G两者的IgG结合域。蛋白A/G有来自蛋白A的四个Fc结合域和来自蛋白G的两个。
[0005]上述各种蛋白质都曾被记载用于纯化免疫球蛋白，其中蛋白A最常用于抗体纯化。一般说来，蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G用于在亲和层析中结合样品中的目标抗体。抗体(结合至蛋白A、G、L或A/G)于是能与样品中大多数其他成分分离，并可以选择再用其他纯化步骤进行纯化。
发明概述
[0006]实施方式之一中，提供的是一种多肽，它含有缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G。一些实施方式中，所述含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个修饰氨基酸，这些修饰封闭了抗体结合活性。一些实施方式中，所述含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个含修饰赖氨酸系氨基酸(lysine amino acids)。一些实施方式中，所述含修饰赖氨酸系氨基酸是乙酰化赖氨酸。
[0007]—些实施方式中，所述含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有交联在蛋白G、蛋白L或蛋白A/G上结合位点或结合位点附近的含Fc片段的蛋白质，由此空间上封闭了抗体结合活性。
[0008]—些实施方式中，所述含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G分别与抗体结合性蛋白G、蛋白L或蛋白A/G相比具有一处或多处氨基酸改变，由此使得这些多肽缺乏抗体结合活性而保留污染物结合活性。
[0009]一些实施方式中，所述含修饰蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有空间封闭的各自的野生型(或抗体结合性变体)，致使这些多肽缺乏抗体结合活性而保留污染物结合活性。
[0010]本发明还提供一种多肽，它包含缺乏抗体结合活性的修饰蛋白A，所述修饰蛋白A包含一个或多个封闭抗体结合活性的修饰氨基酸。一些实施方式中，修饰蛋白A包含一个或多个含修饰赖氨酸系氨基酸。一些实施方式中，含修饰赖氨酸系氨基酸是乙酰化赖氨酸。
[0011]本发明还提供一种固相支持物或支持基质，所述固相支持物或支持基质连接含有0-30°C缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G的多肽。一些实施方式中，所述含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个封闭抗体结合活性的修饰氨基酸。一些实施方式中，所述含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个含修饰赖氨酸系氨基酸。一些实施方式中，所述含修饰赖氨酸系氨基酸是乙酰化赖氨酸。
[0012]一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个与所述蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G交联的含Fc片段的蛋白质，由此封闭了抗体结合活性。
[0013]—些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G与各自的野生型(或抗体结合性变体)相比含有一处或多处氨基酸改变，由此使得这些多肽缺乏抗体结合活性而保留污染物结合活性。
[0014]一些实施方式中，支持基质是珠、膜或纤维。
[0015]本发明还提供一类反应混合物，其中包括含抗体的样品和(1)缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G，例如前文或本文别处所述，或(2)缺乏抗体结合活性的修饰蛋白A，该修饰蛋白A包含一个或多个封闭抗体结合活性的修饰氨基酸。
[0016]本发明还提供从含有抗体和污染物的样品中纯化抗体的方法。一些实施方式中，所述方法包括:使样品与含有缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G的多肽在一定条件下接触，所述条件下至少一些污染物结合到所述多肽上而抗体则不结合所述多肽；将含有抗体的溶液与结合于所述多肽的污染物分离；使含有抗体的溶液与抗体结合性蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G在适宜条件下接触以形成所述抗体与抗体结合性蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G的复合物，由此产生所述复合物与不结合的组分；将不结合的组分与所述复合物分离；由复合物上洗脱抗体，由此产生纯化的抗体。
[0017]—些实施方式中，所述多肽连在支持基质上。一些实施方式中，支持基质为珠、膜或纤维。一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个封闭抗体结合活性的修饰氨基酸。一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个含修饰赖氨酸系氨基酸。一些实施方式中，含修饰赖氨酸系氨基酸是乙酰化赖氨酸。
[0018]一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个与所述蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G交联的含Fc片段的蛋白质，由此封闭了抗体结合活性。
[0019]一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G分别与抗体结合性蛋白G、蛋白L或蛋白A/G相比含有一处或多处氨基酸改变，由此使得这些多肽缺乏抗体结合活性而保留污染物结合活性。
[0020]本发明还提供从含有抗体和污染物的样品中纯化抗体的方法，所述方法包括:使样品与抗体结合性蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G在适宜条件下接触以下形成抗体与活性蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G的复合物，由此产生所述复合物与不结合的组分；将不结合的组分与所述复合物分离；由复合物上洗脱抗体，由此形成含有抗体的洗脱产物；使所得洗脱产物与含有缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G多肽在一定条件下接触，所述条件下至少一些污染物结合到所述多肽上而抗体则不结合所述多肽；将含有抗体的溶液与结合于所述多肽的污染物分离；由此产生纯化的抗体。
[0021]—些实施方式中，所述多肽连在支持基质上。一些实施方式中，所述支持基质是珠、膜或纤维。一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个封闭抗体结合活性的修饰氨基酸。一些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个含修饰赖氨酸系氨基酸。一些实施方式中，含修饰赖氨酸系氨基酸是乙酰化赖氨酸。
[0022]—些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G含有一个或多个与所述蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G交联的含Fc片段的蛋白质，由此封闭了抗体结合活性。
[0023]—些实施方式中，含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G与各自的野生型或抗体结合性变体相比含有一处或多处氨基酸改变，由此使得所述多肽缺乏抗体结合活性而保留污染物结合活性。
发明详述
1.引目
[0024]在此提供用于抗体纯化的修饰形式的蛋白质及其试剂盒和使用方法。具体地说，在此提供的是缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L和蛋白A/G。这些多肽可与具有抗体结合活性的天然蛋白A、蛋白G、蛋白L和蛋白A/G(即具有结合抗体的活性)一起用于抗体纯化，去除因结合天然蛋白A、蛋白G、蛋白L和蛋白A/G而存在于抗体制备物中的污染物。
[0025]因此，一些实施方式中，方法的纯化步骤包括将抗体样品与含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G接触，由此去除原本会或已经随抗体共纯化的污染物。因此，一些实施方式中，蛋白质样品与天然蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G或其抗体结合性变体在适宜条件下接触以结合样品中的抗体，从而将抗体与样品中的至少一些其他组分分离纯化。但是，经如此纯化的抗体混合物仍然可能含有同样结合天然蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G或其抗体结合性变体的污染物。这些污染物然后(紧接上一步或在若干中间纯化步骤之后)可通过将上述经纯化的抗体混合物接触缺乏抗体结合活性的含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G来去除。结合于天然蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G或其抗体结合性变体的污染物会结合到含修饰蛋白A、蛋白G、蛋白L或蛋白A/G，而混合物中的抗体则不会。这样，抗体就能与结合的污染物分离