制备模块融合蛋白表达产物的方法

专利名称：制备模块融合蛋白表达产物的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学方法和实施该方法的产品。更具体地说，本发明涉 及编码模块型蛋白质的核酸的克隆方法，所述模块可顺序加入预定位置。
本申请的主题涉及申请号60/728,259, 60/803,913， 60/821,682， 60/821,958 ， 10/682,764 (US2004/0185556 ， PCT/US2004/013517 ， WO2005/040336), 11/233,246和US2004057201 IP (WO2005116231)。这些
专利和申请各自通过引用纳入本文。
背景和现有技术
本领域己知克隆核酸的重组DNA技术和分子生物学方法。这种方法包括 利用限制性内切酶、连接酶、核苷酸/核苷激酶和磷酸酶、聚合酶及其它分子生 物学工具操作核酸，从而产生所需的重组核酸。已出版的几种实验室手册可以 作为分子生物学研究者的参考书籍。这些参考手册的例子包括Sambrook， J.， E. F. Fritsch和T. Maniatis， 1989，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第二版，冷泉港，纽约冷泉港实验室出 版社；Joseph Sambrook和David Russell, 2001，《分子克隆实验室手册》 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual),第三版，冷泉港，纽约冷泉港 实验室出版社。
本领域的问题之一是缺乏方法来工程改造嵌合蛋白质表达产物，而能方便 地将模块元件插入嵌合体内所需位置。总之，虽然已成功制备了杂交或嵌合蛋 白质，但合成的目的是为在终产物(不想局限于预定的机制)中加入更多的模块。 本发明的一方面考虑到嵌合体及其变体的未来需求和能制备它们而无需每个 都从头开始以解决该问题。本发明的一个实施方式总体上涉及制备融合蛋白表
达产物的方法。本发明的另一实施方式涉及含有预先经工程改造的模块型融合 蛋白表达产物的制备方法。本发明另一方面涉及构建区段分子或模块，这种模 块预先设计成能插入嵌合蛋白质表达盒。本发明还涵盖了可用于所披露方法的 工程改造模块的文库。 一个实施方式制备了含有预定限制性位点的模块。
多肽和多核苷酸序列详述
SEQIDNO: 1是核酸模块的例子。该模块具有如下所示的5'-3'结构 5'-预定的限制性位点-感兴趣多肽的开放读框(ORF)-预定的限制性位点-填 充片段-预定的限制性位点-3'。这种预定的限制性位点和填充片段还编码哺 乳动物的氨基酸并与感兴趣多肽同在框内，因此整个模块是一种组合的开 放读框。SEQIDNO: 1描述于

图11。
SEQIDNO: 2是由SEQ ID NO: 1编码的多肽。
附图简述
图1显示了利用两种环状起始DNA，以N-末端至C-末端方向构建融合蛋
白的方法。
图2显示了利用两种环状起始DNA，以C-末端至N-末端方向构建融合蛋 白的方法。
图3显示了利用一种环状起始DNA和一种线形起始DNA，以N-末端至 C-末端方向构建融合蛋白的方法。
图4显示了利用两种线形起始DNA，以N-末端至C-末端方向构建融合蛋 白的方法。
图5显示以N-末端至C-末端方向构建融合蛋白的循环方法。
图6A-6C显示了嵌合多肽的例子，其中各模块衍生自外显子的各部分。
图7A-7C显示了嵌合多肽的例子，其中一个模块含有定位信号。
图8A-8C显示了融合蛋白的例子，其中一个模块含有表位标签。
图9A-9C显示了融合蛋白的例子，其中诸模块含有不同的功能域。
图10显示了含有本发明方法制备的嵌合蛋白编码序列的示例性表达盒。
图11显示了含有侧接预定限制性位点的感兴趣开放读框(ORF)和填充片 段的示例性模块。
图12显示了本发明可用的模块文库的例子。文库成员含有相同的预定限制性位点，表示为位点I、位点II和位点III。开放读框未按比例绘制，因此长度可能不同。在一个实施方式中，载体DNA包含所述文库成员。在一个实施 方式中，所述载体是环状质粒。
图13显示了釆用动态组合合成制备融合蛋白的方法。该图中的縮写如下 所示N4代表NgoMIV; Xl代表XmaI; Cl代表CIaI; fwd表示正向； rev表示反向；V代表残留的NgoM IV和Xma I位点。
图14A-14D显示了含有模块化嵌合多肽基因构建物的载体的例子。
发明简述
本发明涉及制备模块型嵌合蛋白表达产物的方法和该方法所用的组合物。 具体地说，本发明涉及顺次、定向克隆编码多肽模块的多核苷酸。各可克隆元 件含有侧接预定的限制性位点的开放读框。这些方法包括利用可克隆元件和含 有这些元件的载体作为重组DNA技术的起始材料。本发明的优点之一是能快 速而方便地制备许多融合蛋白变体，而无需设计和评估后续的各克隆步骤。
本发明的一个实施方式通常涉及制备融合蛋白表达产物的方法。本发明的 另一实施方式涉及含有组合模块的融合蛋白表达产物的制备方法。本发明另一 方面涉及构建嵌段分子或模块，这种模块预先设计成能插入嵌合表达盒。本发 明还涵盖了可用于所披露方法的模块文库。 一个实施方式制备了含有预定限制 性位点的模块。
各可克隆元件或模块含有编码感兴趣开放读框，例如但不限于全长蛋白 质或多肽、或功能域、结构域、酶结构域、抑制区、结合区、定位信号、表位、 外显子、或其它所需的亚成分的多核苷酸序列。可从国家医药图书馆获得有关 模块蛋白质信息的数据库，其称为保守性结构域数据库或CDD，该数据库代 表了可根据蛋白质家族和物种之间保守的氨基酸序列同源性来鉴定结构域的 一种来源。
全长蛋白质的非限制性例子包括激酶、激酶亚基、磷酸酶、磷酸酶亚基、
肽配体、蛋白酶、蛋白酶亚基、酶亚基、DNA结合蛋白亚基、g-蛋白亚基、离
子通道亚基和膜受体亚基，仅是举例。
功能域的非限制性例子包括DNA结合区、转录激活区、二聚体化功能域、 催化域、磷酸化区、调节区、死亡结构域、普列克底物蛋白同源结构域、脂 质结合区、激素结合区、配体结合区、锌指区、亮氨酸拉链区、g-蛋白结 合区、糖基化区、酰化区和跨膜区，仅是举例。
结构域的非限制性例子包括a螺旋区、J3片尾区、酸性区、碱性区、疏水 区、链内二硫键区(intra-chaindisufide bonding domain)、辅因子结合区和金属 离子结合区，仅是举例。
酶结构域的非限制性例子包括酶活性位点、憐酸化催化域、磷酸酶催化域、 腺苷酸环化酶催化域、代谢酶活性位点、蛋白酶活性位点、聚合酶活性位点、 酯酶活性位点、糖酵解途径酶活性位点、核苷酸合成酶活性位点、和氨基酸合 成酶活性位点，仅是举例。
抑制区的非限制性例子包括激酶抑制性亚基结合区(kinase inhibitory subunit binding region)、磷酸酶抑制性亚基结合区和别构配体结合区，仅是举 例。
结合区的非限制性例子包括类固醇激素结合区、肽激素结合区、底物结合 区、ATP结合区、PDZ结构域、SH3结构域、SH2结构域、PB1结构域、药 物结合区、g-蛋白结合区、DNA结合区、脂质结合区、碳水化合物结合区和二 聚体化功能域，仅是举例。
定位信号的非限制性例子包括内质网定位信号、核定位信号、线粒体定位 信号、质膜定位信号和肌质网定位信号，仅是举例。
表位的非限制性例子包括血凝素表位、c-Myc表位、FLAGR、 His6、酸 性区、碱性区和抗体结合区，仅是举例。
在自然界中，蛋白质结构域常与外显子有关。据信，天然外显子改组是真 核生物中存在模块蛋白质的一种解释。因此，外显子的开放读框代表了本发明 的感兴趣开放读框。本领域技术人员知道一些外显子在对应于剪接位点的末端含有一些切割密码子(split codon)。当该情况发生时，含有正确开放读框的外 显子部分或区段即是感兴趣的ORF。
模块还可含有编码自然界中不存在，但具有所需特征或特性的肽的多核苷 酸序列。本文所用的术语"模块"表示编码开放读框的核酸，所述开放读框包 括侧接预定限制性位点的感兴趣开放读框。如果将本发明方法和产物用于哺乳 动物系统，所述模块应不含哺乳动物终止密码子。
本发明模块可以是较大多核苷酸，例如载体的一部分。这种载体包括但不
限于环状质粒、表达载体、病毒载体或人工染色体。所述模块中预定的限制
性核酸内切酶位点在该模块内是独特的。在本发明的一个实施方式中，模块的 预定限制性位点在包含该模块的载体或其它核酸内是独特的。在本文中，预定 的限制性位点在载体内提供独特的克隆位点并提供模块克隆的方向。
发明详述
自然界中许多蛋白质是模块化的。例如，核受体的结构域包括DNA结
合区、配体结合区、二聚体化功能区和激活区。常需要在受体之间交换功能区 来制备嵌合受体，从而能研究结构域的功能和/或制作新的研究和治疗工具。也 需要合成具有新的细胞活性或治疗活性的融合蛋白。例如，已从各种异源蛋白
质来源设计并合成了能调节蛋白激酶D活性的嵌合型多重配体(参见 60/728,259)。
本发明一方面涉及融合蛋白的组合模块和制备可掺入融合蛋白表达盒中 任何所需位置的开放读框的构建嵌段。换言之，本发明包括设计成一起使用的 组件库清单，其方式类似于LEGOR构建嵌段或连锁模块底板(interlocking modular flooring)。本发明的其它方面是方便地制备这些模块型融合蛋白的 方法。在该方面，本发明的一个实施方式包括组件蛋白质结构域的模块克 隆方法。
为便于克隆，需要制备与粘性末端相容并能顺次插入和克隆的模块元件。 本发明一实施方式通过利用限制性核酸内切酶位点识别和切割的天然特性实 现该目的。本发明另一方面包括含有开放读框的模块，该开放读框在ORF —
侧的侧接序列用于一次性限制性酶消化，而另一侧的侧接序列如需要可用于多 次限制性酶消化。换言之，利用和破坏模块中的预定限制性位点可实现模块元 件的递推顺次克隆。
实施例l:以两种载体开始的方法
采用以下方法，以两种物质开始制备模块型融合蛋白，这两种物质各含有 侧接预定限制性位点的感兴趣开放读框(ORF)。侧接感兴趣ORF的限制性位点 的例子是限制性内切酶NgoM IV和CIa I;或Xma I和CIa I识别的序列(参 见图l)。参考图l，所述方法的一个实施方式利用两种起始核酸。 一种核酸是 含有感兴趣开放读框(0RF1)的环状DNA，此开放读框的5'端侧接NgoM IV位 点，3'端顺次侧接Xmal位点和CIal位点。换言之，第一种核酸含有从5' 到3'具有以下特征的DNA: —NgoMIV-ORF l-Xmal-填充片段-Cla1—。再 参考图1，第二种核酸是也含有感兴趣开放读框(ORF2)的环状DNA，此开 放读框的5'端侧接NgoMIV位点，3'端顺次侧接Xmal位点和CIaI位点。 填充片段表示为两个不同限制性酶提供了足够空间而可结合和切割此DNA 的核苷酸。术语"填充片段"与"间隔臂"同义，本文中该两术语可互换 使用。填充片段或间隔臂通常应与毗连的开放读框同在框内，因此其长度 应是3的倍数，因为密码子长3个碱基。示例性的填充片段是 GGAGGCGGA，其编码GlyGlyGly。填充片段/间隔臂可含有其它氨基酸组 成。
本发明模块克隆方法的一实施方式包括用Xma I和CIa I切割第一环状 DNA，产生含有3'Xmal突出端和5'CIa I突出端的线形DNA。该DNA片 段是受者DNA(acceptor DNA)，其将接受第二环状DNA的切割后插入物。在 一独立的容器中，用NgoM IV和CIa I切割称为供者的第二环状DNA，产 生释放的含有3' CIaI突出端和5' NgoM IV突出端的线形DNA。然后纯化 该第二 DNA片段使之与其线性化的载体主链DNA分离。这些限制性消化 可产生含有相容粘性端的第一和第二 DNA片段。
当这些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并连接形成第三环状DNA
片段时，第一 DNA中的Xma I位点和第二 DNA中的NgoM IV位点在第三环 状DNA中遭到破坏。现在，DNA的该残留区受到保护以免受Xma I或NgoM IV的进一步消化，但第三环状DNA中侧接所得融合开放读框的序列仍含有完 整的5' NgoM IV和3' Xma I及CIa I位点，从而可用于后续递推克隆步骤。 该方法可重复多次直至实现定向、顺次的、模块化克隆结果。在图1所述 例子中，模块加入的方向从融合蛋白的N-末端至C-末端；而在图2所述例 子中，模块加入的方向从嵌合蛋白的C-末端至N-末端。NgoM IV、 Xma I 和CIaI核酸内切酶识别的限制性位点代表如果用于模块中可进行递推顺次 克隆的三个位点。
本领域技术人员知道NgoM IV位点和Xma I位点彼此可以交换，只要 这种顺序在这些核酸中一致(例如参见图4)。本领域普通技术人员还知道可 用其它限制性位点基团来实现本文所述的顺次定向克隆。选择限制性核酸 内切酶的优选标准是1)选择的一对核酸内切酶应能产生相容的粘性末 端，但彼此连接后其位点遭到破坏；2)选择的第三限制性核酸内切酶不能 产生与前两个粘性末端任何一个相容的粘性末端。当将这种标准用作顺次 定向克隆的系统时，可按需要组合装配蛋白质亚域、模块和其它编码区或 表达组件。
对于上述l号选择标准，可用其它限制性核酸内切酶实施该方法。例如， 当用NgoM IV、 Xma I、 TspM I、 BspE I和Age I切割含有其各自识别位点 的DNA时，均能产生互补的突出端。因此，与本实施例和本文所述其它实 施例中NgoMIV和Xmal的使用方式一样，通常可将退火和连接时识别位 点被破坏的这些酵中的任意两种作为一对应用。
对于表达这种融合蛋白的物种，选择限制性核酸内切酶的其它标准可包括 密码子选择/密码子偏爱。在一个实施方式中，优选NgoMIV与XmaI配对， 因为它们均利用哺乳动物细胞识别的密码子。其它选择标准还可包括密码 子所编码氨基酸的特性。例如，可能需要避免其密码子编码荷电氨基酸的 限制性核酸内切酶位点。在图l所示的实施方式中，NgoMIV和XmaI是 优选的配对，因为所编码的氨基酸相对是生物学中性的(bioneutral): NgoM
IV在哺乳动物中编码AlaGly，而Xma I在哺乳动物中编码ProGly (还参见 图11)。本领域技术人员应知道利用其它物种所用的密码子可改进该方法使 之适用于其它物种。
实施例2:因一种载体开始的方法
除了环状DNA夕卜，定向和顺次装配编码区模块的另一方法利用线形 DNA。例如，与上述顺次克隆方法相似，侧接编码区的限制性位点是限制性内 切酶NgoM IV和CIa I;或Xma I和CIa I所识别的序列。参考图3，用Xma I和CIa I切割第一环状DNA，产生含有3' Xma I突出端和5' CIa I突出端的 线形DNA。该第一DNA是受者。第二DNA是线形双链DNA片段，其通过 合成和退火互补的寡核苷酸或通过PCR扩增然后用合适的限制性内切酶消化 以形成突出端而产生。第二线形DNA含有3' CIa I突出端和5' NgoM IV突出 端，此二突出端与第一线形化DNA受者的粘性末端互补。
当这些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并连接形成第三环状DNA 时，第一 DNA中的Xma I位点和第二 DNA中的NgoM IV位点在第三环状 DNA中遭到破坏。然而，第三环状DNA侧接所得的感兴趣融合蛋白的序列仍 含有完整的5' NgoM IV和3' Xma I及CIa I位点，从而随后可用于连续克隆 步骤中。该方法可重复多次以实现定向、顺次的模块克隆(参见图5)。 NgoM IV、 Xmal和CIaI核酸内切酶识别的限制性位点代表如果用作侧接序列则 可进行递推模块克隆的三个位点。
实施例3:用两种线形双链DNA开始的方法
还可用两种线形DNA作为起始物质来实施本发明方法。在本实施例中， 与本文的其它实施例相比，NgoMIV和XmaI位点已交换。参考图4，所述 两种起始物质是1)含有3'NgoMIV突出端和5'CIal突出端的载体主链， 其中感兴趣的开放读框(ORF Z)位于NgoM IV位点上游，而Xam I位点位 于框内在ORF Z上游；和2)含有5' Xma I突出端和3' CIaI突出端的双链 DNA开放读框，其中Xma I突出端紧邻感兴趣开放读框ORF X上游并与
其同在框内，ORFX下游是NgoMIV位点，也与ORFX同在框内。
可采用各种方法提供或合成该两种起始核酸。例如，通过限制性核酸内切 酶消化、化学合成、PCR扩增，仅是举例。本领域知道这些核酸中的突出端可 以是限制性核酸内切酶消化的产物，或可以作为接头或适体加入各末端。两种 起始核酸的退火和连接可产生上游侧接完整的XamI位点，而下游侧接完整的 NgoM IV和CIa I位点的嵌合型多肽(ORF Z - ORF X)，如果需要加入一个或 多个模块则可重复该方法。NgoM IV或Xma I不再能切割连接的NgoM IV/Xmal区域(表示为残留的NgoMIV、 Xmal位点)，因此受到保护而免 遭这些酶的进一步消化。
实施例4:模块文库
以上实施例中所述的起始物质可以是物质集合或文库的成员。集合的 各成员共享许多特征。共享的最小特征包括侧接感兴趣开放读框的相同预
定限制性位点(例如NgoMIV、 Xmal、 CIaI)。还可工程改造该感兴趣的开 放读框，使其在内部不含这些相同的限制性位点。此外，至少所述第一起 始核酸(受者DNA)是环状DNA，其经工程改造而在整个环状DNA中，即 在感兴趣开放读框的侧接位点处含有这些相同的限制性位点。换言之，受 者DNA载体经工程改造而在任何地方不含这些预定的限制性位点。
在本发明的一个实施方式中，供者和受者核酸均是环状DNA，并且除 了感兴趣的开放读框外均相同。在另一实施方式中，所述供者环状DNA与 受者DNA不同之处在于感兴趣ORF的侧接限制性位点(感兴趣ORF中不 存在)在环状DNA分子中不是独特的。这是可能的，因为可以纯化释放的 插入物使之与载体的其余部分分离。
本领域普通技术人员知道NgoM IV位点和Xmal位点彼此可以交换， 只要这种顺序在这些核酸中一致。本领域普通技术人员还知道可利用其它 限制性位点基团。
在一个实施方式中，所述文库成员具有包含感兴趣开放读框的模块， 所述模块由围绕预定限制性位点的哺乳动物密码子构成，所述位点编码与
该开放读框同在框内的氨基酸，并且其密码子是哺乳动物所用的。图ll显 示了这种文库成员的一个实施方式，其含有感兴趣的多聚赖氨酸ORF。从
图11可以看出，NgoM IV识别序列(GCCGGC)编码AlaGly; ORF
(CCCGGG)编码ProGly;填充片段(GGCGGAGGC)编码GlyGlyGly; Cla I 识别序列(ATCGAT)编码IleAsp。因此，此模块本身是含有感兴趣ORF的 开放读框。此模块文库经工程改造与侧接各开放读框的限制性位点一致， 故可插入各模块而无需设计进行各连续克隆步骤。文库的可用组件包括感 兴趣的开放读框和模块的填充片段和/或间隔臂，只要所有组件能利用要表 达该融合蛋白的物种的密码子，并且每个感兴趣的ORF不含此预定的限制 性位点。
本发明的模块文库不同于本领域已知的其它文库，例如cDNA文库。 虽然cDNA文库通常含有侧接载体限制性位点的蛋白质编码序列，但这些 蛋白质编码序列不一定是开放读框；侧接蛋白质编码序列的载体限制性位 点未经工程改造而不含蛋白质编码序列，这些限制性位点也未经工程改造 而与毗连编码序列同在框内，这些限制性位点也不能进行本发明的递推克 隆步骤。本发明文库与cDNA文库的不同还在于cDNA文库含有非编码序 列，例如3'和5'非翻译区(UTR)。图12显示了本发明所用模块文库的例子。
实施例5:构建均质多聚融合蛋白
均质多聚(homomultimeric)融合蛋白的一个例子是含有，例如ORF 8的 二聚体或多聚体多肽(参见图5)。感兴趣的开放读框ORF 8可以是任何长度 或组成。例如，ORF 8可以是蛋白激酶D的肽抑制剂。当构建本发明环状 DNA的均质多聚体时，两种起始核酸相同。然而，要进行两次分开的限制 性消化。采用实施例1的相同示范性限制性位点位置，在一个容器中用Xma I和Cla I消化一种起始核酸，在另一容器中用NgoM IV和Cla I消化另一 种起始核酸。将线形化的载体DNA与释放的插入物混合、退火并连接得到 ORF 8的融合二聚体。这些步骤可以重复多次直至获得所需数量的模块。如图5所示，还可从两种线形DNA分子开始。本领域技术人员知道所述方 法的改进形式。
实施例6:构建异质多聚融合蛋白
异质多聚(heteromultimeric)融合蛋白的一个例子是含有至少两个不同 模块的多肽。图6A-6C显示了从含有外显子衍生的感兴趣ORF的模块构建 的一些异质多聚融合蛋白。图7A-7C显示了其中一个模块含有定位信号的 示范性融合多肽。图8A-8C显示了其中一个模块含有表位标签的示范性嵌 合多肽。图9A-9C显示了从含有不同功能域的模块构建的示范性嵌合多肽。 本文所述的任何方法可用于制备异质多聚融合多肽。此外，随后可用哺乳 动物细胞表达该融合蛋白。图IO显示了含有本发明制备的嵌合蛋白编码序 列的示范性表达盒。该融合蛋白可用作研究工具或作为治疗剂。
实施例7:分步组合合成
本发明方法可用于同时组合合成几种异质多聚体。虽然消化、纯化、 混合和连接步骤如上所述，但如下所示组合反应容器。本实施例是从4种 环状起始DNA装配可能的每种异质多聚融合蛋白的合成方法，各多聚体含 有命名为模块A、模块B、模块C和模块D的不同模块编码序列。例如， 理论上得到的异质多聚体数量是44个，包括模块A-模块B-模块C-模块D; 模块B-模块C-模块D-模块A;模块C-模块A-模块D-模块B等以及各模块 的均质多聚体。
分别在不同容器中用Xmal和Clal切割使4种不同受者环状DNA线 形化。在另外4个不同的容器中，用NgoM IV和CIa I切割4种不同的插 入供者。纯化供体消化而释放的插入物获得含有NgoM IV和CIa I突出端 的模块A、模块B、模块C和模块D这4种编码DNA。下一步骤是在同一 受者容器中混合等份的各插入物与各受者。因此，各受者得到4种不同的 等份(插入物)。加入各受者的各插入物摩尔浓度是能有效实现所需化学计量 的用量。例如，如果想制备数量大致相同的各类异质多聚体，可在每种受
者DNA中加入各种摩尔数大致相同的4种供者插入物。插入物大小、组成 和其它因素可影响所加入的摩尔数。这4种混合物经退火和连接后，产生 了以下融合二聚体。
含有模块A的受者产生的
模块A-模块A
模块A-模块B
模块A-模块C
模块A-模块D
含有模块B的受者产生的
模块B-模块A
模块B-模块B
模块B-模块C
模块B-模块D
含有模块C的受者产生的
模块C-模块A
模块C-模块B
模块C-模块C
模块C-模块D
含有模块D的受者产生的
模块D-模块A
模块D-模块B
模块D-模块C
模块D-模块D
由于不能用本实施例所用的预定限制性酶消化连接该融合蛋白DNA 各模块的连接键，重复线形化和加入等份插入物的上述步骤可加入更多插 入物。此组合合成方法可用于同时产生大量嵌合体。然后可在细胞中测试 这些嵌合体。
实施例8:动态组合合成
除了上述方法，本发明的模块文库可用于动态组合合成，该方法也能 同时产生大量嵌合体。在同一反应混合物中存在许多相容的突出端并且彼 此能退火和连接时可发生动态组合合成。与从N-末端向C-末端(或反之亦 然)构建融合蛋白的上述递推方法相反，该动态方法产生了反向和正向相连 的没有特定顺序的插入物。虽然融合蛋白构建物的两末端固定粒径于所选 择的模块(类似于上文使用的第一和第二 DNA)，但该融合蛋白的"中段" 部分不同。
在动态组合合成的最简单例子中，用Xma I和CIa I消化本发明DNA 文库的受者DNA。然后用NgoM IV和CIaI消化第二 DNA。此外，用Xma I和NgoM IV消化也来自该文库的第三DNA。分离消化的第二和第三DNA， 从而保留含有感兴趣ORF的多核苷酸。下一步骤是混合、退火和连接第一、 第二和第三DNA。由于第三DNA因其含有NgoM IV和Xma I突出端而可 以两种不同方向与第一和第二DNA退火，所得融合蛋白的"中段"具有两 种不同取向。
动态组合合成的更复杂例子包括将用NgoM IV和XmaI切割的多个模 块与上述消化的第一和第二DNA混合。当退火和连接含有这些突出端的多 种DNA时，各模块发生双向取向连接(bidirectional orientation)。例如，如 果将用NgoM IV和XmaI预先消化的5种模块以粗略相似的化学计量用量 混合、退火并连接时，所述5种模块的每一种都应存在所有可能的顺序和 取向。此外，该融合蛋白的"中段"部分的总长度也可能不同，因为在融 合蛋白中可能有一个或多个模块不存在或存在多次。
图13是动态组合合成的非限制性说明。该图只代表该方法可能产生的 少数融合蛋白构建物。本领域技术人员知道可以获得大量其它融合蛋白构 建物。
在一个实施方式中，本发明包括含有以下每一种元件的载体，这些元 件顺次排列从而形成模块型开放读框，所述载体包含
a)编码第一组氨基酸的第一限制性位点，其中所述第一组氨基酸包括
至少两个氨基酸；
b) 编码感兴趣多肽的第一开放读框，其中所述感兴趣多肽的编码序列 与所述第一限制位点的至少两个氨基酸的编码序列同在框内；
c) 编码第二组氨基酸的第二限制性位点，其中所述第二组氨基酸包括 至少两个氨基酸，所述第二限制性位点的第二组氨基酸编码序列与所述第 一开放读框的感兴趣多肽的编码序列同在框内，所述第二限制性位点的多 核苷酸序列与第一限制性位点的多核苷酸序列不同；
d) 间隔臂子多核苷酸序列，该间隔臂多核苷酸序列编码至少3个间隔 氨基酸，该间隔臂序列的编码序列与第二限制性位点的多核苷酸序列同在
框内；和
e) 编码第三组氨基酸的第三限制性位点，其中所述第三组氨基酸包括 至少两个氨基酸，所述第三限制性位点的第三组氨基酸编码序列与所述至 少3个间隔氨基酸的编码序列同在框内，所述第三限制性位点的多核苷酸 序列与第一限制性位点的多核苷酸序列不同，并且所述第三限制性位点(的 多核苷酸序列)与第二限制性位点的多核苷酸序列不同；
其中元件(a)-(e)彼此同框相连从而形成此开放读框模块。 在另一实施方式中，本发明包括其中诸元件以5'到3'方向排列的载体，
此载体中元件(a)在该载体的5'端。另一实施方式包括其中诸元件以3'到5'
方向排列的载体，此载体中元件(a)在该载体的3'端。
在另一实施方式中，本发明包括的载体还包含与所述模块型开放读框
的5'部分操作性相连的启动子。所述启动子可以是细菌或哺乳动物启动子。
其它实施方式包括还包含与第三限制性位点的3'端相连的非翻译区的载体。
在另一实施方式中，本发明包括或在第一或在第二限制性位点中产生 的第一和第二限制(氨基酸)组之间的任何开放读框中没有限制性位点的载 体。
在另一实施方式中，本发明包括制备融合多肽的方法，包括，
a)用识别第二和第三限制性位点的限制性酶消化上述载体，从而产生
含有第一和第二单链突出端的线形载体，其中所述第一和第二突出端彼此 不相容；
b) 提供第一插入物，此第一插入物包含至少一个其它的开放读框，此 至少一个其它的开放读框包含与所述第一和第二突出端相容的5'和3'突出 端，此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它的感兴趣多肽；
c) 将此第一插入物连接入所述线形载体，从而形成连接的表达载体， 其中至少一个开放读框的5'突出端与所述线形载体的第一单链突出端退火 相连，所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体的第二个单链突 出端退火相连，所述3'突出端的连接重新产生第三限制性位点，所述第一 开放读框与至少一个其它的开放读框彼此同框相连。
在另一实施方式中，本发明包括制备融合多肽的方法，包括，
a) 用识别其它的和重新产生的第三限制性位点的限制性酶消化上述 连接的表达载体，从而产生含有第三和第四个单链突出端的线形载体，所 述第三和第四个突出端彼此不相容；
b) 提供第二插入物，此第二插入物包含至少一个其它的开放读框，此 至少一个其它的开放读框包含与所述第三和第四个突出端相容的5，和3，突 出端，此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它的感兴趣多肽；
c) 将所述第二插入物连接入所述线形载体，从而形成新的连接表达载 体，此载体中至少一个开放读框的5，突出端与所述线形载体的第三个单链 突出端退火相连，所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体的第 四个单链突出端退火相连，所述3'突出端的连接重新产生第三限制性位点，
其中所有开放读框彼此同在框内。
在另一实施方式中，本发明包括制备融合多肽的方法，包括
a) 用识别第二和第三限制性位点的限制性酶消化上述载体，从而产生 含有第一和第二个单链突出端的线形载体，其中所述第一和第二突出端彼 此不相容；
b) 提供第一插入物，此第一插入物包含至少一个其它的开放读框，此 至少一个其它的开放读框包含与所述第一和第二个突出端相容的5，和3，突
出端，此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它的感兴趣多肽；
C)将此第一插入物连接入所述线形载体，从而形成连接的表达载体， 此载体中至少一个开放读框的5'突出端与所述线形载体的第一个单链突出
端退火相连，所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体的第二单 链突出端退火相连，所述3'突出端的连接重新产生第三限制性位点，
其中所述至少一个其它的开放读框与第一开放读框彼此同框相连。
本发明的其它实施方式包括制备融合蛋白DNA构建物的方法，包括
a) 提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感兴趣的开放读 框，各个感兴趣的开放读框侧接至少3个预定的限制性核酸内切酶位点， 其中所述预定位点的2个具有相容的突出端，
b) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化第一多核苷酸，从而产生含有2个不同突出端的 多核苷酸，
c) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化第二多核苷酸物质，从而释放含有感兴趣开放读 框的多核苷酸，此释放的多核苷酸含有2个不同的突出端，其中一个突出 端与步骤b)消化的多核苷酸的突出端相容，
d) 混合、退火和连接步骤b)所产生的多核苷酸与步骤c)的含感兴趣开 放读框的释放多核苷酸，从而产生含有融合开放读框的第三多核苷酸，其 中感兴趣开放读框之间的连接不再易受能在3个预定的限制性位点进行切 割的任何一种核酸内切酶的消化，其中侧接感兴趣的融合开放读框的序列 含有所述3个预定的限制性位点。
在该方法中，第一多核苷酸可以是环状DNA。此外，在该方法中，第 一和第二多核苷酸是环状DNA。另外，所述预定的限制性位点可以是NgoM IV 、 Xma I禾卩CIa I识别的序列。
通过重复步骤a)到d)，可以递推重复该方法，其中步骤a)提供的第一 多核苷酸被步骤d)产生的第三多核苷酸替代。
其它实施方式包括制备融合蛋白DNA构建物的方法，包括a) 提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感兴趣的开放读 框，各个感兴趣的开放读框侧接至少3个预定的限制性核酸内切酶位点， 其中所述预定位点的2个具有相容的突出端，
b) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化所述第一多核苷酸，从而产生含有2个不相容突 出端的多核苷酸，
c) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化第二多核苷酸，其中所用限制性核酸内切酶中的 一种与步骤b)的限制性核酸内切酶相同，从而释放含有感兴趣开放读框的 多核苷酸，此释放的多核苷酸含有2个不相容同的突出端，
d) 混合、退火和连接步骤b)所产生的多核苷酸与步骤c)的含感兴趣开 放读框的释放多核苷酸，从而产生含有融合开放读框的第三多核苷酸，其 中融合的感兴趣开放读框侧接所述预定的限制性位点，此感兴趣开放读框 之间的连接处不含所述3个预定的限制性核酸内切酶位点。
本发明的另一方面是分离多核苷酸的文库，其中各多核苷酸含有侧接 至少3个预定限制性核酸内切酶位点的感兴趣开放读框，这3个预定的限 制性位点中的2个彼此不相容，或3个预定的限制性位点中的2个彼此相 容，各个感兴趣开放读框不含这种预定的限制性位点。更具体地说，该文 库含有多核苷酸，其中每种多核苷酸含有感兴趣的开放读框，各个感兴趣 开放读框在一端侧接可被NgoM IV切割的序列，各个感兴趣开放读框在另 一端侧接可被Xma I和CIa I切割的序列，或此种感兴趣的开放读框不含可 被NgoM IV、 Xma I和CIa I切割的序列。
本发明还包括含有这些分离多核苷酸的载体以及含有所述载体的宿主 细胞。
图14A显示了含有嵌合蛋白基因构建物的载体，此载体中所述基因构 建物可从载体释放，成为产生转基因动物所用的单元。例如，通过限制性 核酸内切酶消化从载体主链释放所述基因构建物(或转基因)。然后将释放的 转基因注入小鼠受精卵的原核；或利用该转基因转化胚胎干细胞。含有图
14A所示基因构建物的载体还可用于转基因的瞬时转染，该转基因的启动 子和密码子按宿主生物作了优化。
与图14B和14C所示基因构建物相连的多核苷酸序列包括基因组整合 功能区以促进此转基因整合入病毒基因组和/或宿主基因组。
图14D显示了可用于产生稳定细胞系的含嵌合蛋白基因构建物的载体。
权利要求
1. 一种载体，其含有以下每一种元件，这些元件顺次排列而形成模块型开放读框，所述载体包含a)编码第一组氨基酸的第一限制性位点，其中此第一组氨基酸包括至少两个氨基酸；b)编码感兴趣多肽的第一开放读框，其中此感兴趣多肽的编码序列与上述第一限制位点的至少两个氨基酸的编码序列同在框内；c)编码第二组氨基酸的第二限制性位点，其中此第二组氨基酸包括至少两个氨基酸，其中上述第二限制性位点的第二组氨基酸编码序列与上述第一开放读框的感兴趣多肽编码序列同在框内，其中上述第二限制性位点的多核苷酸序列与第一限制性位点的多核苷酸序列不同；d)间隔臂多核苷酸序列，其中此间隔臂多核苷酸序列编码至少3个间隔氨基酸，其中此间隔臂序列的编码序列与上述第二限制性位点的多核苷酸序列同在框内；和e)编码第三组氨基酸的第三限制性位点，其中此第三组氨基酸包括至少两个氨基酸，其中上述第三限制性位点的第三组氨基酸编码序列与上述至少3个间隔氨基酸的编码序列同在框内，其中上述第三限制性位点的多核苷酸序列与第一限制性位点的多核苷酸序列不同，并且第三限制性位点与第二限制性位点的多核苷酸序列不同；其中元件(a)-(e)彼此同框相连从而形成模块型开放读框。
2. 如权利要求l所述的载体，其特征在于，所述诸元件以5'到3'方向 排列，其中元件(a)在载体的5'末端。
3. 如权利要求l所述的载体，其特征在于，所述诸元件以3'到5'方向 排列，其中元件(a)在载体的3'末端。
4. 如权利要求l所述的载体，其特征在于，所述感兴趣多肽选自下组: 全长蛋白质或多肽、蛋白质功能域、蛋白质结构域、蛋白质的酶结构域、蛋白 质抑制区、蛋白质结合区、蛋白质定位结构域和表位。
5. 如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述感兴趣多肽是蛋白质 定位结构域。
6. 如权利要求l所述的载体，其特征在于，所述第一限制性位点易受 限制性酶作用而产生含有至少2个核苷酸的第一单链突出端，所述第二限 制性位点易受限制性酶作用而产生含有至少2个核苷酸的第二单链突出端， 其中所述第一和第二突出端彼此互补，从而使所述第一和第二突出端在合 适条件下能彼此退火。
7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述第一限制性位点包含 NgoM IV限制性酶识别的多核苷酸序列。
8. 如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述第二限制性位点包含 Xmal限制性酶识别的多核苷酸序列。
9. 如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述第三限制性位点包含 CIaI限制性酶识别的多核苷酸序列。
10. 如权利要求9所述的载体，其特征在于，所述间隔臂多核苷酸序 列编码3个甘氨酸。
11. 如权利要求1所述的载体，其特征在于，还包含与所述模块型开 放读框的5'部分操作性相连的启动子。
12. 如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述启动子是细菌启动子。
13. 如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述启动子是哺乳动物 启动子。
14. 如权利要求ll所述的载体，其特征在于，还包含与所述第三限制 性位点的3'端相连的非翻译区。
15. 如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一开放读框紧连 所述第二限制性位点。
16. 如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述第一开放读框不紧 连所述第二限制性位点。
17. 如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述第一开放读框与第二限制性位点之间插入了至少一个其它的开放读框，其中此至少一个其它 的开放读框各自与所述第一开放读框和第二限制性组同在框内，其中所述 其它的开放读框各自编码至少一种其它的感兴趣多肽。
18. 如权利要求17所述的载体，其特征在于，在所述第一或第二限制 性位点中产生的所述第一和第二限制性组之间的任何开放读框中没有限制 性位点。
19. 如权利要求18所述的载体，其特征在于，所述载体包含至少两个 开放读框。
20. 如权利要求19所述的载体，其特征在于，所述载体包含至少3个 开放读框。
21. —种制备融合多肽的方法，包括，a) 用识别第二和第三限制性位点的限制性酶消化权利要求6所述的载 体，从而产生含有第一和第二单链突出端的线形载体，其中该第一和第二 突出端彼此不相容；b) 提供第一插入物，其中此第一插入物包含至少一个其它的开放读 框，其中此至少一个其它的开放读框包含与所述第一和第二个突出端相容 的5'和3'突出端，其中此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它 的感兴趣多肽；c) 将第一插入物连接入所述线形载体，从而形成连接的表达载体，其 中所述至少一个开放读框的5'突出端与所述线形载体的第一个单链突出端 退火相连，其中所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体的第二 个单链突出端退火相连，所述3，突出端的连接重新产生第三限制性位点， 其中所述至少一个其它的开放读框与第一开放读框彼此同框相连。
22. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第一插入物还包含 至少一个其它的间隔臂多核苷酸序列，并包含识别第二限制性位点的同一 限制性位点识别的其它限制性位点。
23. —种制备融合多肽的方法，包括，a)用识别上述其它的和重新产生的第三限制性位点的限制性酶消化如权利要求22所述的连接表达载体，从而产生含有第三和第四个单链突出 端的线形载体，其中所述第三和第四个突出端彼此不相容；b) 提供第二插入物，其中此第二插入物包含至少一个其它的开放读 框，其中此至少一个其它的开放读框包含与所述第三和第四个突出端相容 的5，和3'突出端，其中此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它 的感兴趣多肽；c) 将所述第二插入物连接入所述线形载体，从而形成新的连接表达载 体，其中所述至少一个开放读框的5'突出端与所述线形载体的第三个单链 突出端退火相连，其中所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体 的第四个单链突出端退火相连，其中所述3'突出端的连接重新产生第三限 制性位点，其中所有开放读框彼此同在框内。
24. —种制备融合多肽的方法，包括a) 用识别第二和第三限制性位点的限制性酶消化如权利要求9所述的 载体，从而产生含有第一和第二个单链突出端的线形载体，其中所述第一 和第二突出端彼此不相容；b) 提供第一插入物，其中此第一插入物包含至少一个其它的开放读 框，其中此至少一个其它的开放读框包含与所述第一和第二个突出端相容 的5'和3'突出端，其中此至少一个其它的开放读框各自编码至少一个其它 的感兴趣多肽；c) 将第一插入物连接入所述线形载体，从而形成连接的表达载体，其 中所述至少一个开放读框的5'突出端与所述线形载体的第一个单链突出端 退火相连，其中所述至少一个开放读框的3'突出端与所述线形载体的第二 个单链突出端退火相连，其中所述3'突出端的连接重新产生第三限制性位 点，其中所述至少一个其它的开放读框与第一开放读框彼此同框相连。
25. —种制备融合蛋白DNA构建物的方法，包括a)提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感兴趣的开放读框，其中各个感兴趣的开放读框侧接至少3个预定的限制性核酸内切酶位 点，其中所述预定位点的2个具有相容的突出端，b) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化第一多核苷酸，从而产生含有2个不同突出端的 多核苷酸，c) 用能在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不 同限制性核酸内切酶消化第二多核苷酸，从而释放含有感兴趣开放读框的 多核苷酸，其中此释放的多核苷酸含有2个不同的突出端，其中所述突出 端之一与步骤b)消化的多核苷酸的突出端相容，d) 混合、退火和连接步骤b)所产生的多核苷酸与步骤c)的含感兴趣开 放读框的释放多核苷酸，从而产生含有融合开放读框的第三多核苷酸，其 中感兴趣开放读框之间的连接不再易受在3个预定的限制性位点进行切割 的任何一种核酸内切酶的消化，其中侧接感兴趣的融合开放读框的序列含 有所述3个预定的限制性位点。
26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一多核苷酸是环 状DNA。
27. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述第一和第二多核苷 酸是环状DNA。
28. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述预定的限制性位点 是NgoM IV、 Xma I和CIa I的识别序列。
29. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括重复步骤a)到d)， 其中步骤a)提供的第一多核苷酸被步骤d)产生的第三多核苷酸替代。
30. —种制备融合蛋白DNA构建物的方法，包括a) 提供第一和第二多核苷酸，其中各多核苷酸含有感兴趣的开放读 框，其中各个感兴趣的开放读框侧接至少3个预定的限制性核酸内切酶位 点，其中所述预定位点的2个具有相容的突出端，b) 用在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不同 限制性核酸内切酶消化第一多核苷酸，从而产生含有2个不相容突出端的多核苷酸，c) 用在所述预定限制性核酸内切酶位点的2个处进行切割的2种不同限制性核酸内切酶消化第二多核苷酸，其中所用的限制性核酸内切酶中的一种与步骤b)的限制性核酸内切酶相同，从而释放含有感兴趣开放读框的 多核苷酸，其中此释放的多核苷酸含有2个不相容同的突出端，d) 混合、退火和连接步骤b)所产生的多核苷酸与步骤c)的含感兴趣开 放读框的释放多核苷酸，从而产生含有融合开放读框的第三多核苷酸，其 中融合的感兴趣开放读框侧接所述预定的限制性位点，其中此感兴趣开放 读框之间的连接处不含所述3个预定的限制性核酸内切酶位点。
31. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第一多核苷酸是环 状DNA。
32. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第一和第二多核苷 酸是环状DNA。
33. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述预定的限制性位点 是NgoM IV、 Xma I和CIa I的识别序列。
34. 如权利要求30所述的方法，其特征在于，还包括重复步骤a)到d)， 其中步骤a)提供的第一多核苷酸被步骤d)产生的第三多核苷酸替代。
35. —种分离多核苷酸的文库，其中各多核苷酸含有侧接至少3个预 定限制性核酸内切酶位点的感兴趣开放读框，其中此3个预定的限制性位 点中的2个彼此不相容，其中此3个预定的限制性位点中的2个彼此相容， 其中各个感兴趣开放读框不含这种预定的限制性位点。
36. —种分离的多核苷酸，其含有感兴趣的开放读框，其中此感兴趣 开放读框在一端侧接可被NgoMIV切割的序列，其中各个感兴趣开放读框 在另一端侧接可被Xmal禾卩CIaI切割的序列。
37. —种分离多核苷酸的文库，其中各多核苷酸含有感兴趣的开放读 框，其中各个感兴趣开放读框在一端侧接可被NgoMIV切割的序列，其中 各个感兴趣开放读框在另一端侧接可被XmaI和CIaI切割的序列，其中感 兴趣的开放读框不含可被NgoMIV、 Xmal和CIaI切割的序列。
38. —种载体，其包含如权利要求37所述的分离多核苷酸。
39. —种重组宿主细胞，其包含如权利要求38所述的载体。
全文摘要
本发明涉及制备模块型嵌合蛋白表达产物的方法以及用于所述方法的组合物。具体地说，本发明涉及顺次、定向克隆编码多肽模块的多核苷酸。各可克隆元件或模块含有侧接预定的限制性位点的感兴趣开放读框。这些方法包括利用模块和含有这些模块的载体作为重组DNA技术的起始材料。本发明的优点之一是能快速而方便地制备融合蛋白的许多变体，而无需设计和评估后续的各克隆步骤。
文档编号C12N1/00GK101395263SQ200680038790
公开日2009年3月25日 申请日期2006年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者T·里德 申请人:英特瑞克斯顿股份有限公司