复3次。
[0060] (4)分别在培养箱中培养到24、4化、7化后，取出在室溫或者37°C下，用膜酶消化 液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。取盖玻片、计数载玻片各一块，先用PBS清洗干净，再用 75%酒精反复擦拭计数载玻片和盖玻片，然后风干，盖上盖玻片，用1化1移液枪吸取细胞 悬液5μ1由盖玻片一侧缓慢的滴入计数载玻片中，使载玻片和盖玻片之间均匀的充满细 胞悬液体。
[0061] (5)再用10 X物镜显微镜下，观察计数载玻片上四角计数格内所含细胞的总数X。 计数原则:细胞压中线时，数上不数下，数左不数右，细胞团块合计为一个细胞。将计数所得 细胞总数代入公式，得出细胞密度= X/4X104个/ml(细胞数/毫升原液）。
[0062] 结果如图6和7所示，从图6中得出，当PGP-2浓度大于25μg/ml时，随着时间的增长， 化la细胞的生长受到抑制。当PGP-2浓度5(K)μg/ml时，与对照组相比4她细胞存活率降低了 约10%，7化细胞存活率降低了约25%。
[0063] 从图7中得知，与对照相比，0-3天，随着PGP-2浓度的增加，细胞的增殖受到明显抑 制。
[0064] 5、PGP-2抑制半乳凝集素-3活性： (1)鸡红细胞的分离纯化:采集新鲜的鸡血，倒入盛有Alsever液的烧杯中摇匀，防止 凝血。加入5倍体积0.15 Μ化C1将鸡血洗五次，2500巧m离屯、10 min;弃上清，向沉淀中 加入0.02M PBS，将细胞悬起，制成4%的悬液，再用5倍体积0.15 Μ化C1将细胞洗4次，2500 巧m离屯、10 min,弃上清；用0.02Μ PBS悬起沉淀，用PBS洗细胞2次，最后将细胞用PBS 悬起，4 °C条件保存。
[0065] (2化ela细胞的培养：将化la细胞从液氮罐中取出复苏，培养于含10%胎牛血清和 双抗(青霉素 lOOU/πα和10化g/ml链霉素）的DMEM完全培养基中，放置于37 °C、5%0)2培养箱 中培养，待细胞融合度达到90%左右时进行传代或者保种。
[0066] (3)乳腺癌MCF-7细胞的培养：同（2)。
[0067] (4化ela细胞的处理:从C02培养箱中取出化la细胞，于超净台下用0.25%膜蛋白酶 消化液消化贴壁的单层培养细胞，然后2500巧m离屯、10 min,弃上清；用0.02M PBS悬起 沉淀，用PBS洗细胞2次，最后将细胞用PBS悬起，4°C条件保存。
[006引巧)乳腺癌MCF-7细胞的处理：同（4) (6)细胞凝集最适的Galectin-3浓度筛选：用PBS配制不同浓度的Galectin-3溶 液，同时将制备好的红细胞用PBS稀释成4%悬液。于V型96孔板中分别加入不同浓度(2化 g/ml、50μg/ml、100μg/ml)的Galectin-3,再向每孔中依次加入25μ1生理盐水、2扣1 1% BSA W及25μ1 4%鸡红细胞，总体积为10化1。室溫静置30 min,观察红细胞凝集情况。用 化la细胞和乳腺癌细胞系MCF-7时筛选最适Galectin-3浓度的方法与鸡血红细胞相同。
[0069] (7)PGP-2对Galectin-3 活性抑制作用： 样品准备:取不同浓度(2^ig/ml、50μg/ml、75μg/ml)的PGP-2为25μ1 分别与 Galectin- 3混合，室溫静置10 min。
[0070] 加样:实验孔依次加入：1%BSA、糖样与Galectin-3的混合物，混匀后加入4%的 红细胞。阳性对照孔依次加入：l%BSA、Galactose与Galectin-3混合物，混匀后加入4〇/〇 的红细胞。阴性对照孔依次加入：1%BSA、0.15 Μ化C1与Galectin-3混合物，混匀后加入 4%的红细胞25μ1。
[0071 ]观察:室溫静置90min后观察红细胞的凝集程度，用完全抑制红细胞凝集所需糖 样的最小浓度表示糖样的抑制活性，即完全抑制红细胞凝集所需糖样浓度越小，表示该糖 样的抑制能力强，与Galectin-3的结合能力越强。
[0072] 化la细胞与乳腺癌MCF-7细胞的凝集实验步骤与鸡血红细胞的凝集实验相同。
[0073] 从W上实验获得，当PGP-2浓度为50μg/ml时，血凝集现象消失，PGP-2的对 Galectin-3的最小抑制浓度(MIC)为50μg/ml。
[0074] 对Galectin-3介导Hela细胞的凝集中，当PGP-2浓度为200μg/ml时，Galectin-3介 导的细胞凝集消失，PGP-2的最小抑制浓度(MIC)为20化g/ml。
[0075] 对MCF-7细胞的凝集抑制中得到，当PGP-2浓度为10化g/ml时，Galectin-3介导的 细胞凝集消失，PGP-2的最小抑制浓度(MIC)为10化g/ml。
【主权项】
1. 一种桃胶多糖降解产物PGP-2,其特征在于，所述PGP-2由微杆菌A5接种至桃胶培养 基上获得发酵液，分离纯化获得； 所述微杆菌A5于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC N0:M209174； 所述分离纯化采用阴离子交换进行，洗脱为采用NaCl溶液进行梯度洗脱。2. 根据权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-2,其特征在于，所述NaCl溶液的梯度 洗脱浓度分别为〇 · lmol/L、0 · 2mol/L、0 · 3mol/L、0 · 4mol/L、0 · 5mol/L、0 · 6mol/L、0 · 7mol/L、 0· 8mol/L、0·9mol/L、1·Omol/L; 所述PGP-2为0 · 2mol/LNaCl溶液洗脱后的产物。3. 根据权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-2，其特征在于，所述PGP-2的制备具体 包括如下步骤：51. 将菌种活化，得到种子液；52. 将S1中所得种子液接种至桃胶培养基，进行发酵培养，S2中发酵温度为20~40°C， 初始桃胶浓度4~8%，培养基pH为4~6，摇床转速为160~200rpm，得到发酵液；53. 将S2中所得发酵液进行分离纯化，得到所述PGP-2; 所述S3中包括如下步骤：531. 将S2中所得发酵液离心，得到桃胶多糖液，然后过滤，依次将过滤产物经过脱蛋 白、醇沉、干燥后，得到干燥产物；532. 将S31中所得干燥产物经过阴离子交换、浓缩、透析、除杂、干燥后即得所述PGP-2。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S2中发酵温度为30°C，初始桃胶 浓度8%，培养基pH为4，摇床转速为160rpm，接种量为3%。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1中菌种活化为将所述菌种在4 °C保存斜面菌种，营养琼脂平板划线，37 °C倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试管培 养基，于200rpm转速，37°C下震荡培养12h。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S31中脱蛋白采用Sevage法脱蛋 白，所述S31中醇沉为采用75%的乙醇。7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S32中浓缩为采用聚乙二醇8000 进行浓缩处理，所述透析为采用截留分子量200的透析袋。8. 权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-2在制备促进肠道益生菌和天然多糖抗氧 化剂及抗肿瘤产品中的应用。9. 权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-2在制备抑制血红细胞、He 1 a细胞、乳腺癌 MCF-7细胞聚集产品中的应用。10. -种半乳凝集素-3抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的桃胶多糖降解产物 PGP-2;所述PGP-2抑制半乳凝集素-3介导的红细胞聚集的最小抑制浓度为50μg/ml;所述 PGP-2抑制半乳凝集素-3介导的Hela细胞聚集的最小抑制浓度为200μg/ml;所述PGP-2抑制 半乳凝集素-3介导的MCF-7细胞聚集的最小抑制浓度为100yg/m。
【专利摘要】本发明提供了一种桃胶多糖降解产物PGP-2，所述PGP-2由微杆菌A5接种至桃胶培养基上获得发酵液，分离纯化获得；所述微杆菌A5于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC？NO:M209174；所述分离纯化采用阴离子交换进行，洗脱为采用NaCl溶液进行梯度洗脱。本发明的提供的PGP-2制备简单，并能够显著促进双歧杆菌的增长，抑制屎肠球菌的增长，且具备较强的对羟基自由基和DPPH˙自由基的清除能力，能够显著抑制Hela？细胞的生长及增殖，Galectin-3介导的细胞凝集抑制实验表明，其能够显著抑制Galectin-3介导的红细胞、Hela细胞以及MCF-7细胞的聚集。
【IPC分类】A61P39/06, C12P19/14, A61P1/00, C08B37/00, C12R1/01, C12P19/04, A61P35/00
【公开号】CN105669874
【申请号】CN201610072050
【发明人】冉艳红, 王伟, 李弘剑, 周天鸿, 杨晓萍, 王雅秋
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月2日