专利名称：悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法
技术领域：
本发明涉及一种悬浮细胞脂质体转染方法，尤其是一种操作方法简单，可对悬浮细胞高效转染外远性基因(miR或SiRNA)的悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法。
背景技术：
基因转移技术对于现代生命科学有着十分重要的意义。通常的外源性基因包括microRNA (miR)转染细胞的方法主要有磷酸韩沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体转染法、逆转录病毒介导转染法、电穿孔转染法等。不同的转染方法各有不同的优缺点，其中脂质体转染法制备过程相对比较简单，不需要特殊的仪器，并且具有毒性低、包装容量大、研究周期短等优点而被广泛应用。以质粒DNA转染为例，现有脂质体转染的操作步骤是
1.将细胞铺于细胞培养板的培养孔内，用无抗生素培养基培养过夜； 2.将DNA质粒溶于50ul无血清的Opti— MEM I Reduced Serum Medium中，混合均
匀；
3.将适量Lipofectamine2000溶于50ul无血清的Opti — MEM I中，混合均勻，在室温下孵育5分钟；
4.将上述两种混合物混合(总体积IOOul)均匀，在室温下孵育25分钟得复合物；
5.在细胞培养板(24孔板)的每个培养孔中加入IOOul的复合物以及适量培养基,十字法混合均匀；
6.细胞在37°CC02培养箱中培养18 48个小时。由于脂质体转染是基于电荷吸引的原理，先形成脂质体-DNA或RNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，因此，脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。目前，为了提高悬浮细胞脂质体转染率，通常采用对细胞培养板预处理的方法，即先将转染用的细胞培养板用纤连蛋白(fibronectin)包被，然后在细胞培养板中加入悬浮细胞，随后离心约一小时使细胞处于“贴壁”状态。即使如此，其转染率最高也很难达到要求，分析其原因如下
I.纤连蛋白是与细胞粘附有关的分子，其是细胞外基质的重要成分，也是⑶44和整合素家族某些成员的配体之一，是整合素a 5 P I在人体的特异配体。在白血病研究领域，有研究发现，整合素a 5 ^ I仅大量表达于慢性粒细胞白血病祖细胞上，但由于其功能存在缺陷而导致细胞异常增殖和黏附功能下降。因此，在白血病研究领域用纤连蛋白包被转染用的细胞培养板，虽然可使悬浮细胞“贴壁”，但并没能够真正提高细胞的转染效率；
2.离心不但操作复杂、费时费力，而且可使部分悬浮细胞损伤，直接影响转染效率
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作方法简单，可对悬浮细胞高效转染外源性基因UiR或siRNA)的悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处
理方法。本发明的技术解决方案是一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，其特征在于按如下步骤进行
a.将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至lmg/ml ；
b.将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；
c.静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；
d.紫外线照射30分钟。
本发明对细胞培养板预处理后，无需离心，既可使悬浮细胞“粘附”于细胞培养板上(类似悬浮细胞贴壁)，加大了脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会，有效提高了悬浮细胞的转染效率(至少可达70%)，可对悬浮细胞高效转染外源性基因(miR或siRNA)，操作简单、省时省力。
图I是本发明实施例I显微镜镜下结果图。图2是本发明实施例I FCM检测olig NC-FAM转染NB4细胞的转染效率示意图。图3是本发明实施例2 FCM检测olig NC-FAM转染U937细胞的转染效率示意图。
具体实施例方式实施例I :
a.将多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)用无菌三蒸水溶解至lmg/ml；
b.将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔上，既可将a步骤所得溶液加入培养孔内，轻轻摇动使之完全覆盖培养孔表面；
c.静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干，；
d.紫外线照射30分钟。 使用前，先用少量培养液洗，加入需要转染的NB4悬浮细胞，37度5%C02孵箱孵育，静置2小时左右，NB4悬浮细胞即可实“贴壁”(粘附于细胞培养板似贴壁细胞)，然后按照lipo2000转染贴壁细胞的方法进行转染olig NC-FAM。转染6h后换液一次；转染后72h，显微镜观察结果见图1，图中A荧光检测结果，B白光对照结果。荧光显微镜下转染olig NC-FAM的细胞可见荧光，而对照组细胞未见荧光；随后，流式细胞仪测得转染效率为72. 31%(见图2)。图2中左上、左下为olig NC转染NB4细胞72小时的检测结果；图2中右上、右下为olig NC-FAM转染NB4细胞72小时的检测结果。实施例2:
a.将多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)用无菌三蒸水溶解至lmg/ml；
b.将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔上，即将a步骤所得溶液加入培养孔内，轻轻摇动使之完全覆盖培养孔表面；
c.静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；d.紫外线照射30分钟。转染方法均同实施例1，所用细胞为U937悬浮细胞，转染后，测得转染效率为99.8% (见图3)。图3 中左上、左下为olig NC转染U937细胞24小时的检测结果；图3中右上、右下为olig NC-FAM转染U937细胞24小时的检测结果。
权利要求
1.一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，其特征在于按如下步骤进行a.将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至lmg/ml；b.将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；c.静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；d.紫外线照射30分钟。
全文摘要
本发明公开一种悬浮细胞脂质体转染用细胞培养板预处理方法，按如下步骤进行将多聚赖氨酸用无菌三蒸水溶解至1mg/ml；将a步骤所得溶液均匀覆盖在细胞培养板的培养孔表面；静置5分钟后，弃溶液，用无菌三蒸水洗培养孔表面，晾干；紫外线照射30分钟。本发明对细胞培养板预处理后，无需离心，既可使悬浮细胞“粘附”于细胞培养板上(类似悬浮细胞贴壁)，加大了脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会，有效提高了悬浮细胞的转染效率(至少可达70%)，可对悬浮细胞高效转染外源性基因(miR或siRNA)，操作简单、省时省力。
文档编号C12N15/88GK102719480SQ20121023362
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月8日 优先权日2012年7月8日
发明者李传刚, 李墨林, 舒晓宏 申请人:大连医科大学