专利名称：一种食管鳞癌原代瘤株ch-h-2的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于原代瘤异种移植肿瘤模型领域，特别涉及一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用。
背景技术：
食管癌(主要为鳞状细胞癌)是全球第九大恶性疾病，在全球许多地区流行，特别是在发展中国家。在中国，食管癌的发病率更高，在所有肿瘤发病率中居第4位，男性食管癌年发病率及死亡率分别是22. 47/10万及16. 65/10万，发病及死亡人数分别是147629与109435人，女性食管癌年发病率及死亡率分别是11. 10/10万及8. 50/10万，发病及死亡人数分别是68853与52711人。我国食管癌的年总发病与死亡人数达216482与162146人。中国人食管癌年发病及死亡人数分别占全世界食管癌总发病与死亡人数的52. 5%与41.8%，是ー种严重危害人民群众身体健康的疾病。随着人们对肿瘤性质及肿瘤细胞株模型研究的不断深入，细胞株自身所存在的不足也日渐为人们所认识。期间人们注意到，往往有一些曾经在临床前研究中取得理想治疗效果的抗肿瘤药物在后期临床验证中效果差强人意，甚至与前期结果大相径庭。目前广为采用的由肿瘤细胞株及其移植瘤构建的药筛平台与临床实际治疗效果之间还存在着明显的差异。由于肿瘤细胞株通常是由少数甚至是单个的肿瘤细胞扩增而得，因此细胞株模型往往反映的是部分肿瘤细胞的性质。尤为重要的是，越来越多的研究表明，肿瘤细胞在建株过程中为了获得体外贴壁生长及长期传代能力，其细胞功能及遗传性状都会进行相应的调整，并由此而导致某些重要的生物学特性发生改变，其中包括基因表达的开启或关闭(Pandita A, Aldape KD, Zadeh G et al. Contrasting in vivo and invitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. GenesChromosomes Cancer 2004;39 (I):29-36)、(De Witt Hamer PC,Van Tilborg AAj EijkPP et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early inprimary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene 2008;27 (14):2091-6);迁移及转移能力变化(Vescovi AL, Galli R, Reynolds BA. Brain tumour stem cells. NatRev Cancer 2006; 6 (6) : 425-36);肿瘤干細胞群比例失衡以及信号传导通路的改变等等(Clement V，Sanchez P，de Tribolet N et al. HEDGEH0G-GLI1 signaling regulateshuman glioma growth,cancer stem cell self-renewal, and tumorigenicity.CurrBiol 2007;17(2):165-72)、(Sasai K，Romer JTj Lee Y et al. Shh pathway activity isdown—regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinicalstudies. Cancer Res 2006; 66 (8) :4215-22)。进ー步的研究表明，即使将肿瘤细胞株细胞植入免疫缺陷小鼠而恢复其三维生长形式，上述改变也不能因此而得到纠正[6]。可以想见，肿瘤细胞株模型与原代肿瘤性质上的不同，势必造成抗肿瘤药物临床前研究与实际临床治疗效果之间的严重脱节。
为了克服肿瘤细胞株模型所存在的不足，有学者曾一度尝试建立鼠源肿瘤在体模型并试图通过观察抗肿瘤药物对鼠源肿瘤细胞的杀伤作用来推测其对人源肿瘤的治疗效果。但后续的研究发现，相同的抗肿瘤药物对人源与鼠源肿瘤的治疗效果相差迥异，鼠源肿瘤模型对临床治疗效果的提示作用甚至差于传统的肿瘤细胞株模型(TeicherBA. Human tumor xenografts and mouse models of numan tumors:re-discovermgthe models. Expert Opin Drug Discov 2009;4(12) : 11)、(Richmond A, Su Y.Mousexenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech2008; I (2-3) : 78-82)。为此，ー些学者另辟蹊径，采用将人体新鲜肿瘤组织直接植入免疫缺陷小鼠体内构建原代瘤异种移植肿瘤模型(Morton CL, Houghton PJ. Establishment ofhuman tumor xenografts in immunodef icient mice. Nat Protoc 2007;2(2):247-50)、(Sausville EA, Burger AM. Contributions of human tumor xenografts to anticancerdrug development. Cancer Res 2006; 66 (7) : 3351-4，discussion 4)。初步的研究结果显示，三维生长条件下构建的原代瘤异种移植肿瘤模型能更好地模拟肿瘤细胞在人体内的实际生长状況。原代瘤异种移植肿瘤模型不仅能更好地反映肿瘤细胞在人体内的生长特性，而且能在保持性状稳定的前提下传代扩增及长期保存。由此可见，建立原代瘤异种移植肿瘤模型不仅有助于加深对肿瘤生长规律的了解和认识，而且可望籍此建立更为贴近临床实际治疗效果的抗肿瘤药物筛选平台，其在未来肿瘤研究中的重要性是不言而喻的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，该原代瘤株CH-H-2可通过N0D/SCID小鼠多次传代,对于解决远处转移这个目前食管鳞癌治疗中无法回避的瓶颈问题，具有重要意义，是食管鳞癌基础研究和临床前期应用的理想対象。本发明的一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，用于在哺乳动物中产生食管鳞癌细胞。所述原代瘤株CH-H-2还包括原代瘤株的子代肿瘤组织。所述哺乳动物为小鼠。 所述小鼠为N0D/SCID小鼠。所述原代瘤株CH-H-2及其子代肿瘤组织的制备方法包括(1)N0D/SCID小鼠于接种前Id接受钴60-Y射线辐照预处理，辐照剂量为2. 5Gy/只；(2)腹腔注射戊巴比妥钠麻酔小鼠，将原代食管鳞癌组织剪成小组织块，背部皮下接种小鼠，产生第一代移植瘤，成瘤率100% ；(3)第一代移植瘤直径超过IOmm后，处死荷瘤小鼠；将瘤组织剪成小块并再次皮下接种N0D/SCID小鼠，产生第二代移植瘤，其余移植瘤组织冷冻保存，重复该过程直至第40代移植瘤形成并进行性质鉴定，冷冻保存。有益效果(I)本发明的食管鳞癌原代瘤株性状稳定，可通过N0D/SCID小鼠多次传代；(2)本发明的食管鳞癌原代瘤株具有临床上食管鳞癌的生物学性状，具备高转移潜能的特性。对于解决远处转移这个目前食管鳞癌治疗中无法回避的瓶颈问题，具有重要意义，是食管鳞癌基础研究和临床前期应用的理想对象。
图I为原代食管鳞癌(左)与第40代瘤株移植瘤(右)组织大体形态HE染色(a)、p75 (NTR) (b)、p63 (C)、^ 1-integrin (d)和 ^ 4-integrin (e)的比较图；图2为原代食管鳞癌(左)和第40代移植瘤(右)的组织石蜡切片，Ki-67免疫组化染色； 图3为原代食管鳞癌(左)和第40代移植瘤(右)的组织石蜡切片，PCNA免疫组化染色； 图4为原代食管鳞癌(左)和第40代移植瘤(右)通过流式细胞仪检测的増殖指数；图5为原代食管鳞癌(左)和第40代移植瘤(右)通过流式细胞仪检测的凋亡指数。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II.原代食管鳞癌异种移植肿瘤瘤株的建立(I)实验动物N0D/SCID小鼠，4-6周龄，雌雄不拘，购自第二军医大学实验动物中心。(2)肿瘤组织取自于第二军医大学附属长海医院胸心外科2006年10月进行手术的I例48岁男性III a期食管鳞癌患者的新鮮食管肿瘤组织标本。(3)原代瘤异种移植成瘤及传代扩增①N0D/SCID小鼠于接种前Id接受钴60- y射线辐照预处理，辐照剂量为2. 5Gy/只。②腹腔注射戊巴比妥钠(0.05mg/g体重)麻酔小鼠，原代食管鳞癌组织剪成约3X3X3mm的小组织块，背部皮下接种小鼠，产生第一代(Fl)移植瘤，成瘤率100%。③Fl移植瘤直径超过IOmm后，处死荷瘤小鼠。将瘤组织剪成约3X 3X 3mm的小块并再次皮下接种N0D/SCID小鼠，产生第二代(F2)移植瘤，其余移植瘤组织冷冻保存。重复该过程直至第40代(F40)移植瘤形成并进行性质鉴定。(4)移植瘤深低温保存及复苏后成瘤①取各传代移植瘤组织，将其剪成约IXlXlmm的小组织块，DMEM培养基漂洗组织，500rpm离心5min，弃上清。组织块按体积比I : I加入保护液(含20%胎牛血清及10%DMS0的DMEM培养基)，混匀后分装于多个冻存管内。冻存管于4°C预冷lOmin，随后置于程控降温仪内并按以下程序降温4°C起始，-0. 50C /min至_30°C，随后_5°C /min至-100°C，取出冻存管置于液氮罐中保存。@移植瘤组织冻存1，6，12，24月后分别取出？1{10{20{30{40各ー支冻存管，37°C水浴中迅速解冻，DMEM培养基清洗组织后，500rpm离心5min去上清，按照前述方法取组织块皮下接种NOD/SCID小鼠，比较不同冻存时间对移植瘤组织成瘤能力的影响。本研究发现直至第40代(F40)冻存24个月的瘤株成瘤率与原代瘤株及其他各代瘤株成瘤率无区别，均为100%o2.原代食管鳞癌异种移植肿瘤瘤株的性质鉴定(I)瘤株表型分析取原代食管鳞癌和对应的FI、F10、F20、F30、F40移植瘤的组织，固定后行常规石腊包埋切片，HE染色比较不同来源瘤组织大体形态；p75(NTR)、p63、involucrin、3 1-integrin和P 4-integrin免疫组化染色 比较蛋白表达水平及阳性细胞分布情况。结果证实各传代瘤株在表型分析与原代肿瘤无明显差別。(图I)(2)瘤株增殖能力分析①取原代食管鳞癌和对应的FI、F5、F10、F15、F20、F30、F40移植瘤的组织石蜡切片，Ki-67、PCNA染色比较不同来源瘤组织中增殖细胞比例；TUNEL染色比较肿瘤细胞凋亡率。结果证实各传代瘤株在増殖细胞比例、肿瘤细胞凋亡率无显著差异。(图2、图3)②取原代食管鳞癌和对应Fl、FlO、F20、F30、F40移植瘤的新鲜组织，将其剪成约IXlXlmm的小组织块，IV型胶原酶/透明质酸酶消化获得单细胞悬液，通过流式细胞仪检测不同来源肿瘤细胞的増殖指数(细胞周期分析法)和凋亡指数(AnnexinV/7-AAD双标法)。结果证实各传代瘤株在増殖指数、凋亡指数无显著差异。(图4、图5)以上结果表明食管鳞癌原代异种移植瘤株CH-H-2不仅能更好地反映肿瘤细胞在人体内的生长特性，而且能在保持性状稳定的前提下传代扩增及长期保存。该瘤株的建立不仅有助于加深对肿瘤生长规律的了解和认识，而且可望籍此建立更为贴近临床实际治疗效果的抗肿瘤药物筛选平台。
权利要求
1.一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，其特征在于用于在哺乳动物中产生食管鳞癌细胞。
2.根据权利要求I所述的一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，其特征在于所述原代瘤株CH-H-2还包括原代瘤株的子代肿瘤组织。
3.根据权利要求2所述的一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，其特征在于所述原代瘤株CH-H-2及其子代肿瘤组织的制备方法包括 (DNOD/SCID小鼠于接种前Id接受钴60-Y射线辐照预处理，辐照剂量为2. 5Gy/只； (2 )腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，将原代食管鳞癌组织剪成小组织块，背部皮下接种小鼠,产生第一代移植瘤,成瘤率100% ； (3)第一代移植瘤直径超过IOmm后，处死荷瘤小鼠；将瘤组织剪成小块并再次皮下接种NOD/SCID小鼠，产生第二代移植瘤，其余移植瘤组织冷冻保存，重复该过程直至第40代移植瘤形成并进行性质鉴定，冷冻保存。
4.根据权利要求I所述的一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，其特征在于所述哺乳动物为小鼠。
5.根据权利要求4所述的一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2的应用，其特征在于所述小鼠为NOD/SCID小鼠。
全文摘要
本发明涉及一种食管鳞癌原代瘤株CH-H-2用于在哺乳动物中产生食管鳞癌细胞。本发明原代瘤株CH-H-2可通过NOD/SCID小鼠多次传代，对于解决远处转移这个目前食管鳞癌治疗中无法回避的瓶颈问题，具有重要意义，是食管鳞癌基础研究和临床前期应用的理想对象。
文档编号C12N5/09GK102766600SQ20121023275
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者倪逸倩, 李白翎, 袁扬, 陶婧, 黄盛东, 龚德军 申请人:中国人民解放军第二军医大学