专利名称：一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗黄曲霉生长技术领域，具体涉及一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用。
背景技术：
绿色木霉菌(Trichoderma viride)属半知菌亚门，丛孢梗目，丛孢梗科，是当前公认的具有应用前景的生防菌，能够防治多种病害。绿色木霉菌以其资源丰富、持效期长、作用方式独特、对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。在国内外研究中，利用木霉菌防治作物的猝倒病、立枯病、灰霉病、纹枯病等均取得了良好的效果。碱性蛋白酶(Alkaline ftOtease)，属于丝氨酸孢外高碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子，具有较强的分解蛋白质的能力，是重要的细胞壁裂解酶，在绿色木霉与其它病原菌的相互作用中起到主要作用。目前，对碱性蛋白酶的研究较少，Geremia等(1993)从哈茨木霉(Trichoderma harzianum) IMI206040菌株中分离到1种丝氨酸蛋白酶基因prbl，并证明它与菌寄生过程有关。Jestis 000 等从哈茨木霉中分离出1种天冬氨酰蛋白酶基因papA，并在酵母中高效表达。但到目前为止，对绿色木霉菌中碱性蛋白酶的研究则未见报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种绿色木霉碱性蛋白酶。本发明的另一目的在于提供所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法。本发明的再一目的在于提供上述绿色木霉碱性蛋白酶的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种绿色木霉碱性蛋白酶，其氨基酸序列如下所示MAIIRRLALYLGALLPAVLAAPAALHKKPFAVPNKFIVTLKFGASIDTDSHLAWVNDLHRRSLTKRSTAGVEKTYNIHTWSAYAGEFDDETIEQIKSSPDVGCVCGARLHHVPVGHCDRQACFDYTIRCSLGSRHC
FPSHIWVHKLHLSSLSffRWNFCLRSSLRYQHLPSAIRRACQPffLACCRGAACTYSffSffYSCFRNNCfflYIWRCQAGLPNLRVSLLWRALHHLYYPRRLWLGRERHCLAEPCKQICYMYVAffRTCFIYLDDRHQRSLQPGCAYHCRRWGWRLSRKPPTSLQHFSCVRTARHHCCSTGHQLAHCFLHQLffCffCVRFCPffCICSVSffIGSNTATNTISGTSMATPHVVGLALYLQSLEGLSTPTAVTNRIKALATTGRVTGSLRGSPNSIIFNGHSA;所述绿色木霉碱性蛋白酶，其核苷酸序列如下所示ATGGCCATCATCCGTCGTCTTGCTCTCTATCTCGGAGCCTTGCTCCCGGCTGTCCTCGCCGCTCCCGCAGCTCTTCATAAGAAGCCGGAGGCTGTACCTAACAAGTTTATTGTCACTCTGAAAGAGGGCGCTTCCATTGATACAGACTCTCATCTCGCCTGGGTAAATGACCTCCACCGTCGATCTTTGACCAAGCGTAGCACTGCTGGTGTTGAAAAGACTTATAACATTCATACTTGGAGTGCTTATGCGGGCGAGTTTGATGACGAGAC
AATTGAGCAGATCAAGTCTAGTCCCGATGTAGGTTGCGTCTGTGGAGCCAGACTACATCATGTACCTGTCGGACATTGTGACAGACAAGCGTGCTTTGACTACACAATCCGGTGCTCCTTGGGGTCTCGGCACTGTTTCCCATCGCACATCTGGGTCCACAAGCTACATTTAAGCTCACTCAGCTGGCGCTGGAACTTTTGCCTACGTAGTTCCCTCCGGTATCAACACCTCCCATCAGCAATTCGGCGGGCGTGCCAGCCTTGGCTAGCTTGCTGCAGGGGGGCAGCATGTACTTACTCTTGGTCATGGTACTCATGTTTCCGGAACAATTGCTGGATCTACATTTGGCGTTGCCAGGCAGGCCTACCTAATCTCCGTGTCAGTCTTCTCTGGAGAGCTCTCCACCACCTCTATTATCCTCGACGGCTATGGCTGGGCCGTGAACGACATTGTCTCGCGGAACCGTGCAAACAAATCTGCTATATGTATGTCGCTTGGAGGACCTGCTTCATCTACCTGGACGACCGCCATCAACGCAGCCTTCAGCCAGGGTGTGCTTACCATTGTCGCCGCTGGGGCTGGAGACTCTCTAGGAAACCCCCAACCAGTCTCCAGCACTTCTCCTGCGTTCGTACCGCTCGCCATCACTGTTGCAGCACTGGACATCAATTGGCGCACTGCTTCCTTCACCAACTATGGTGCTGGTGTGTCCGTTTTTGCCCCTGGTGTATTTGTTCTGTCTCATGGATTGGATCTAACACTGCCACCAACACAATTAGCGGCACTTCAATGGCTACACCTCACGTTGTCGGTCTGGCTCTCTATCTTCAATCCCTTGAAGGTCTCTCCACTCCCACCGCTGTCACTAATCGGATCAAAGCTCTGGCTACCACTGGCCGCGTAACCGGCAGCCTTAGAGGTAGCCCTAACTCTATCATCTTCAACGGACACAGTGCTTAA ；所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法，包含以下步骤将绿色木霉碱性蛋白酶的编码序列克隆至真核表达载体中，转化宿主细胞，进行诱导和表达。所述的真核表达载体优选pPICZ α A载体；所述宿主优选为毕赤酵母表达菌株 GS115。所述绿色木霉碱性蛋白酶应用于制备抑制黄曲霉生长的制剂。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明首次从绿色木霉中分离得到一种碱性蛋白酶，并且证实了该碱性蛋白酶具有抑制黄曲霉生长的功能。
图1是绿色木霉碱性蛋白酶全长cDNA的PCR扩增产物的电泳检测图，其中泳道M 为 DL2000 Marker ；泳道1为PCR扩增产物，箭头处为目的片段。图2是SDS-PAGE电泳图，其中箭头处为目标蛋白。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1(1)绿色木霉菌株的分离及鉴定①分离土样取自广东省汕头市花生种植田土壤。称取土样10g，放入盛有IOOml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇勻IOmin使土和水充分混合。在无菌操作条件下，用移液枪从三角瓶中吸取lml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均勻，依此类推分别制成10-2、10_3、10-4不同稀释度的土壤溶液。
②涂布培养及划线分离以10_2及10_3两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养的对象，将其涂布在PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)固体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 15g，pH6.8，蒸馏水定容至1000ml)上，每个样3个重复，28°C培养3天后，对平板中的微生物进行观察，用接种环挑取平板中长势旺盛的拟拮抗菌株进行划线分离，得到纯培养物。接着对纯培养进一步筛选利用牛津杯双层平板法将纯培养物的发酵液对黄曲霉进行抑菌活力的测定(所用的黄曲霉为黄曲霉GIM3. 17，购于中科院微生物所)，得到了不仅能抑制黄曲霉菌丝的生长，还能抑制黄曲霉孢子的萌发的黄曲霉拮抗菌GZ101。③菌株鉴定A、形态学鉴定平板上菌落形态特征将接种针经火焰灭菌并待冷却后，从斜面上挑取少量黄曲霉拮抗菌GZlOl菌体，接种于平板的中间位置，倒置于25°C培养7 14天，观察菌落特征。 结果表明，在察氏固体培养基上，生长较差，菌丝稀疏，培养7天后有稀疏的绿色产孢子丛束区，菌落反面无色；在麦芽汁固体培养基上生长快，培养7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，黄绿色的产孢区，有辐射状沟纹，菌落反面无色；在PDA固体培养基上生长速度快，培养 7天后菌丝铺满整个平皿，最初为白色致密的基质菌丝，而后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产孢丛束区，常排成同心轮纹，深黄绿色至深蓝绿色的产孢区，菌落反面无色。显微镜下形态特征观察用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少量黄曲霉拮抗菌 GZlOl菌体，置载玻片的水滴中，加盖盖玻片。于显微镜下观察其形态特征。发现其菌丝透明，壁光滑，有隔，直径1.5 8μπι，厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上，多数为球形，少数为椭圆形，透明，壁光滑；分生孢子梗为菌丝的短侧枝，其上对生或互生分枝，分枝上继续分枝，形成二级、三级分枝，小梗瓶形成锥形，基部稍窄，中部较宽，从中部以上变窄成长颈，(8 12) X O. 5 3) μ m,分生孢子多数为球形，直径2. 5 4. 5 μ m，少数孢子为短倒卵形，(4 5) X (3. 5 4) μ m。根据以上培养特征及显微形态特征结果，查《真菌鉴定手册》及《真菌的形态和分类》可知，该菌与绿色木霉菌(Trichoderma viride)最相似。B、分子生物学方法进行鉴定黄曲霉拮抗菌GZlOl的DNA的提取将GZlOl菌株接种于PDA固体培养基中，28°C 恒温培养3 5天后，将菌丝转移至灭过菌的研钵中，用液氮将菌体迅速研磨成粉末后，用基因组提取试剂盒提取基因组DNA。PCR扩增以提取的DNA为模板，用真菌通用弓丨物ITSl (5’ -TC0GTAGGTGAACCTGCGG-3‘)、 ITS2(5，-GCTGCGTTCATCGATGC-3，)扩增 18S rDNA 基因。PCR 反应体系为试剂体积2 χ PCR Master Mix5 μ L引物ITSl (浓度为 10 μ Μ)IuL引物ITSl (浓度为 10 μ Μ)IuL基因组DNA (浓度为 10ng/uL)5 μ L灭菌水定容至50 μ L反应条件
94"C 5min ；940C lmin，56°C lmin，72°C 2min(30 个循环)；72 °C 7min ；4°C 保存。将扩增条带回收后送往上海英俊公司测序，测序序列如下所示。将测得的18S rDNA基因序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。结合形态特征，确定黄曲霉拮抗菌GZlOl为绿色木霉菌(Trichoderma viride)。将该菌株命名为绿色木霉GZ101，于2010年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2010291ο测序序列
权利要求
1.一种绿色木霉碱性蛋白酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID:N0. 1所示。
2.权利要求1所述绿色木霉碱性蛋白酶，其核苷酸序列如SEQID:N0.2所示。
3.权利要求1所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法，其特征在于包含以下步骤 将权利要求2所述绿色木霉碱性蛋白酶的核苷酸序列克隆至真核表达载体中，转化宿主细胞，进行诱导和表达。
4.根据权利要求3所述的真核表达方法，其特征在于所述的真核表达载体为 PPICZ α A载体；所述宿主为毕赤酵母表达菌株GSl 15。
5.权利要求1所述绿色木霉碱性蛋白酶应用于制备抑制黄曲霉生长的制剂。
全文摘要
本发明公开了一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用。该绿色木霉碱性蛋白酶的编码序列通过RACE方法得到，氨基酸序列长度为410个氨基酸，编码序列长度为1233个核苷酸。该绿色木霉碱性蛋白酶的编码核苷酸序列构建于真核表达载体中，进行真核表达，能得到具有抑制黄曲霉生长的色木霉碱性蛋白酶。该绿色木霉碱性蛋白酶具有抑制黄曲霉生长的功能。
文档编号C12N9/58GK102168080SQ20101058908
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘付香, 刘海燕, 张二华, 李玲, 梁炫强, 温世杰, 陈小平 申请人:广东省农业科学院作物研究所