专利名称：一种草莓nced基因及其载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说涉及一种草莓NCED基因与该基因植物表达 载体的构建。
背景技术：
脱落酸作为一种在植物的整个生命循环中起着重要作用的激素，在植物胚胎发 育、种子休眠与萌发、果实成熟以及植物对逆境胁迫的响应等许多方面具有广泛的生理效 应，对植物的生长发育起着重要的作用。ABA的间接合成途径需要经聚合、环化、异构化、氧 化、裂解等一系列复杂的反应变化，其中很多细节问题还不清晰，对其调节机理的研究也才 刚刚起步，合成过程中涉及的各种基因如何表达，各种酶的特异性也有待进一步证实。9-顺 式环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)催化9-顺式-紫黄质和9-顺式新黄质裂解形成黄质 醛，此步骤被认为是植物ABA生物合成的关键步骤，NCED被认为是ABA合成中的一个关键 酶，对ABA的合成调控起到了十分重要的作用，NCED在果实成熟、萎蔫、缺水等过程或条件 下对ABA的合成起着关键的调节作用。目前并没有关于草莓NCED基因的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种草莓NCED基因及其载体的构建，为研究草莓ABA合成 代谢机制奠定了基础，
本发明采取的技术方案如下
本发明的基因Λ 来源于草莓(/^^aria ananassa Duch )，该基因的核苷酸序 列是以下核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID NO :1ο2)与序列表中SEQ ID NO 1限定的cDNA序列具有90%以上同源性，且编码相 同功能蛋白质的cDNA序列。草莓ΛΟ恐基因编码的9-顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶蛋白序列，编码具有序列 表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列或与序列表中SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至 少95%的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。本发明还提供了一种草莓NCED基因的植物表达载体的构建。本发明的有益效果
本发明从草莓中克隆了 9-顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶的编码基因，该基因在 成熟、萎蔫、干旱、高温和抵温等过程或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。本发明 为研究草莓ABA合成代谢机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累 提供基因源。
图1为草莓Λ 基因的克隆；其中A 基因的保守区产物；B 基因的3’ RACE产物；C :Λ ￡ 基因的5’RACE产物；C :0RF克隆；D 全长基因克隆；M:DNA分子量标 准DL2000 ；
图2为ρΒΙ121-ΛΚ￡ 限制酶分析；其中1 -.Xba I私BamH I双酶切ρΒΙ121_ΛΚ￡ ; M X-EcoT 14 I digest。
具体实施例方式实施例1草莓NCED基因的克隆
采用Trizol说明提取草莓果实总RNA。按大连宝生物有限公司的I^rimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，逆转录引物AP序列为 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC (T)17-3'。根据genebank里大豆、豇豆、菜豆、莱iNCED基因序列设计一 对保守区简并引物，上游附5 ‘ -GGK CACCACTTCTTCGACGG-3 ‘，下游N2 5' -CTCTTCAAACTCTCVTCGCATTC-3‘，以这两个引物进行PCR扩增，扩增出842 bp的片段， 如图IA所示。根据草莓ΛΟ沿基因保守区克隆测序结果，设计3'端顺式引物N3，引物序列 为5' -ATCTGGGTTGAGTCGCCGG-3 ‘，与通用引物AUAP配对进行PCR扩增，AUAP序列为 5' -GGCCACGCGT CGACTAGTAC-3‘。根据 3' RACE 的原理，扩增出了 3'端8(^bp 的片段， 如图IB所示，其中包括一个含19个腺苷酸的poly (A)0根据草莓已获得的ΛΟ沿基因测序的基础上，设计了 2个5端反式引物，分别为N4 5' -AAGAGGCGGTCGTTGAAGTA-3 ‘和 P5:5' -GTCTCCCGATTTCACGCTCC-3 ‘。以大连宝生物 有限公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为基础，以N4为引物 合成cDNA第一链，cDNA第一链加同聚物尾，在加尾的基础上进行cDNA第二链的合成，产物 用于PCR扩增。N5与通用引物AUAP配对进行PCR扩增。根据5' RACE的原理，扩增出了 5'端581的片段，如图IC所示。根据草莓ΛΟ沿保守区序列、5'端、3'端序列结果，拼接出全长cDNA，分别设计 ORF引物N6和N7以及全长引物N8和N9，进行NCED cDNA ORF和全长克隆，验证已获得的 序列，如图 1 中 D、E 所示，4 个引物的序列为 N6 5' -ATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG-3‘，N7 5' - CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC -3' , N8 5' - GAAACAAAACACATAAAACACCTTGC -3' , N9 5' - AAGGCAGAACTCCTAAATATTTACC -3'。草莓ΛΚ 全长cDNA为序列表中SEQ ID NO :1，该cDNA全长22 bp，两端含有53 bp的5'非编码区和345 bp的3'非编码区，以19个腺苷酸的poly (A)结尾。具有完 整的开放阅读框(第讨个碱基 第1880个碱基)，共1827个碱基，编码609氨基酸，编码序 列表中SEQ ID NO 2蛋白质。实施例2草莓NCED基因植物表达载体构建
根据草莓ΛΟ沿基因cDNA全序列的编码区、植物表达载体pBI121的多克隆位点，设计 一对特异引物用于双 基因完整开放阅读框的扩增，分别在5'和3'引入Zh l.BamH I 酶切位点(NCEDX :5，-GCTCTAGAATGGCTACTCCTTCGAATAGTTG-3 ‘ ；NCEDB 5，-CGGGATCC CTATGCCTGGTTTTTCAAGGC-3 ‘ )，PCR扩增产物经损a I和BatnH I双酶切，回收基因片 段。植物表达载体PBI121质粒用损a I和I双酶切，回收载体片段。将Λ 基因片段和PBI121的载体片段在T4连接酶的作用下16°C连接过夜，连接产物转化感受态Ε. coli DH5 α，涂在含有Kan的LB平板上，挑取单菌落分别以PCR、酶切和测序进行验证，如图2所 示，鉴定为阳性的重组表达质粒命名为ΡΒΙ121-ΛΚ 即为构建好的植物表达载体。
权利要求
1.一种草莓NCED基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列是以下核苷酸序列之一1)如SEQ ID NO 1 所示；2)与SEQID NO 1具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的cDNA序列。
2.根据权利要求1所述的草莓NCED基因，其特征在于所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示或与SEQ ID NO 2具有至少95%的同源性并具有相同功能的氨基酸序列。
3.含有如权利要求1或2所述基因的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体转化的转基因植物。
全文摘要
本发明提供了一种草莓NCED基因及其载体的构建，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示或与SEQ ID NO1具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的cDNA序列。本发明从草莓中克隆了9-顺式环氧类胡萝卜素双氧合酶的编码基因，该基因在成熟、萎蔫、干旱、高温和抵温等过程或条件下对ABA的合成起着关键的调节作用。本发明为研究草莓ABA合成代谢机制奠定基础，为通过基因工程调控植物体内ABA的代谢和积累提供基因源。
文档编号C12N15/29GK102094033SQ20101058951
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者朱海生 申请人:福建省农业科学院作物研究所