专利名称：一种双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种以干马铃薯叶为原料，采用双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法。
背景技术：
茄尼醇(Solanesol)是长链半萜烯醇化合物，是一种不饱和的九聚异戊二烯伯醇，属四倍半萜醇，具有独特的链状隔离多烯结构，可以做为很多药物合成的重要原料，在生物化学中有着非常重要的作用。主要存在于茄科植物中，如烟叶、茄子叶、马铃薯叶、桑叶等。茄尼醇具有抗菌、消炎、抗溃疡和治疗心血管疾病等作用。在医学上应用广泛，可作为泛醌类药物、抗过敏药、抗溃疡药、降血脂药和抗癌药物的合成原料中间体。茄尼醇以游离态和化合态形式广泛存在于高等植物体内，化合态的茄尼醇主要为茄尼醇的脂肪酸酯。中国专利CN 101298410A于2008年11月5日报道了一种“采用皂化、 萃取与低温结晶离心结合提取茄尼醇的方法及其设备”，该方法用30%的茄尼醇粗品制得的茄尼醇含量为70.02% ；中国专利CN101497557A于2009年8月5日公开了“从马铃薯叶(陇薯6号)中提取纯化茄尼醇的方法”，通过微波辅助萃取、皂化、柱层析、结晶和重结晶等工艺，能得到纯度95%以上的茄尼醇。中国专利CN17M492A于2006年1月25日公开了“一种从烟草中提取茄尼醇的方法”，经过常规的溶剂提取、皂化、洗剂和浓缩后得到纯度23%以上的茄尼醇粗品；专利ZL200610048708. X于2007年3月21日报道了“一种有效提高茄尼醇粗品含量的方法”，该发明是将含量为7 12%的茄尼醇粗品用C1-C8的烷烃溶解，再用碱的醇溶液混合石油醚等进行洗剂，制得含量大于25%的茄尼醇粗品；中国专利CN1762940A于2006年4月沈日公开了“一种从马铃薯叶(陇薯6号)和废弃烟叶中提取纯化茄尼醇的方法”，该方法是用油做提取剂，通过提取、皂化、结晶最终可得到纯度为 90%的茄尼醇产品；中国专利ZL20071018M66. 3于2008年5月21日申请了一种“从马铃薯叶(陇薯6号)、烟叶和/或烟杆中提取纯化茄尼醇的方法”，采用浸提法提取原料中的茄尼醇后，经皂化、除蜡和结晶及重结晶等工艺，能获得纯度98%以上的茄尼醇；中国专利 CN1712392A于2005年12月观日公开了 “一种从马铃薯叶(陇薯6号)中提取茄尼醇的方法”，经过常规的溶剂提取、皂化、结晶和硅胶柱层析等流程后得到纯度90%以上的茄尼醇。以上工艺的不足之处是在提取前对材料未进行预处理，所以提取后需要皂化，碱液易造成环境污染，而本发明的纤维素酶和脂肪酶辅助提取茄尼醇的方法对材料在提取茄尼醇前进行了破壁处理，并将结合态的茄尼醇释放出来，省去了皂化环节，该工艺是一种绿色的生产工艺。迄今国内外文献、专利均未涉及以马铃薯叶为原料，以纤维素酶和脂肪酶法辅助提取茄尼醇的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法。该方法利用纤维素酶改变马铃薯叶细胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解结合态的茄尼醇，克服了传统工艺直接提取后接着纯化或试剂提取后用碱皂化导致茄尼醇降解或异构化，从而得率较低的缺点。为解决上述技术问题，本发明提供一种双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法，该方法包括如下步骤1)将干马铃薯叶粉碎后过40目 60目筛，加入蒸馏水，干马铃薯叶原料与蒸馏水的质量与体积比为20g IOOml 400ml，在超声波功率150 250W、频率40KHz、温度 30°C 60°C条件下超声水洗20 60min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用pH4.0 5.6的柠檬酸缓冲液配制的浓度为0. OOlg/ ml 0. 004g/ml的纤维素酶液，干马铃薯叶原料与所述纤维素酶液的质量体积比为 20g IOOml 300ml，在温度30°C 60°C、搅拌速度100 120r/min条件下酶解1 5 小时，并在3600 4000转/分钟条件下离心10 15min，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入用pH7 9的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的质量浓度为0. 001g/ml 0. 006g/ml的脂肪酶液，干马铃薯叶原料与脂肪酶液的质量体积比为 20g IOOml 500ml，在温度30°C 60°C、搅拌速度100 120r/min条件下酶解1 5 小时，再在3600 4000转/分钟下离心10 15min，然后弃除上清液得物质C ；4)向物质C中加入95%乙醇，干马铃薯叶原料与95%乙醇的质量体积比为 20g 300ml 600ml，在微波频率M50MHz、功率为200 400W、温度30°C 60°C、搅拌速度60 lOOr/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度，50°C条件下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品D， 粗制品D中，所述茄尼醇的含量为15 19%，茄尼醇的收率为87% 92%。上述方法中，所述的马铃薯叶优选为陇薯6号马铃薯叶。利用高效液相色谱法测定本发明中涉及的各种茄尼醇制品的茄尼醇含量，测定条件如下高效液相色谱参数色谱柱Cw洗脱剂甲醇乙醇的体积比=40% 60%洗脱速率lml/min，检测波长211nm。本发明的特点和产生的有益效果是本发明是以干马铃薯叶为原料，用纤维素酶法和脂肪酶辅助提取茄尼醇粗制品的方法；利用纤维素酶改变马铃薯叶细胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解结合态的茄尼醇，克服了传统工艺直接提取后接着纯化或试剂提取后用碱皂化导致茄尼醇降解或异构化，从而得率较低的缺点。此法比现有技术高效、废液排放量少，是一种环境友好的绿色生产技术。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明图1为茄尼醇标品和本发明制备的茄尼醇粗制品的高效液相色谱图。
具体实施例方式实施例1
本发明一种纤维素酶法和脂肪酶辅助提取茄尼醇的方法，包括如下步骤1)将干马铃薯叶(陇薯6号)粉碎后过60目筛，准确称取马铃薯叶40克，加入 800ml蒸馏水，在超声波功率150W、频率40KHz、温度50°C条件下超声水洗40min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用pH5. 6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的浓度为0. 002g/ ml纤维素酶液600ml，在温度50°C、搅拌速度120r/min条件下酶解5小时，并在4000转/ 分钟条件下离心13min，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入用pH8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的浓度为 0. 006g/ml的脂肪酶液200ml，置于磁力搅拌器设备中，在温度40°C、搅拌速度lOOr/min条件下酶解5小时，再在3800转/分钟下离心15min，然后弃除上清液得物质C ；4)向物质C中加入95%乙醇1200ml，在微波频率2450MHz、功率为400W、温度 50°C、搅拌速度60r/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度、50°C下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品D， 茄尼醇的含量为19%，茄尼醇的收率为92%。实施例2本发明一种纤维素酶和脂肪酶辅助提取茄尼醇的方法，包括如下步骤1)将干马铃薯叶(陇薯6号)粉碎后过50目筛，准确称取马铃薯叶40克，加入 200ml蒸馏水，在超声波功率200W、频率40KHz、温度30°C条件下超声水洗60min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用pH4. O的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的浓度为0. 004g/ ml纤维素酶液400ml，在温度30°C、搅拌速度llOr/min条件下酶解3小时，并在3800转/ 分钟条件下离心lOmin，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入用pH9的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的浓度为 0. 003g/ml的脂肪酶液600ml，置于磁力搅拌器设备中，在温度30°C、搅拌速度llOr/min条件下酶解1小时，再在3600转/分钟下离心lOmin，然后弃除上清液得物质C ；4)向物质C中加入95%乙醇900ml，在微波频率M50MHz、功率为300W、温度30°C、 搅拌速度80r/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度、50°C下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品D，茄尼醇的含量为17%，茄尼醇收率为87%。实施例3本发明一种纤维素酶和脂肪酶辅助提取茄尼醇的方法，包括如下步骤1)将干马铃薯叶(陇薯6号)粉碎后过40目筛，准确称取马铃薯叶40克，加入 500ml蒸馏水，在超声波功率250W、频率40KHz、温度60°C条件下超声水洗20min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用pH4. 8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的浓度为0. OOlg/ ml纤维素酶液200ml，在温度60°C、搅拌速度lOOr/min条件下酶解1小时，并在3600转/ 分钟条件下离心15min，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入用pH7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的浓度为 0. 001g/ml脂肪酶液1000ml，置于磁力搅拌器设备中，在温度60°C、搅拌速度120r/min条件下酶解3小时，再在4000转/分钟下离心12min，然后弃除上清液得物质C ；4)向物质C中加入适量95%乙醇600ml，在微波频率M50MHz、功率为200W、温度 60°C、搅拌速度lOOr/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度、50°C下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品 D，茄尼醇含量为15%，茄尼醇收率为87%。比较例本发明提供一种以马铃薯叶(陇薯6号)为原料，常规提取茄尼醇粗产品的方法， 包括如下步骤1)将干马铃薯叶(陇薯6号)粉碎后过60目筛，准确称取马铃薯叶40克，加入 800ml蒸馏水，在超声波功率150W、频率40KHz、温度50°C条件下超声水洗40min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用PH8的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的浓度为 0. 006g/ml的脂肪酶液200ml，置于磁力搅拌器设备中，在温度40°C、搅拌速度lOOr/min条件下酶解5小时，再在3800转/分钟下离心15min，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入95%乙醇1200ml，在微波频率2450MHz、功率为400W、温度 50°C、搅拌速度60r/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度、50°C下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品D， 茄尼醇的含量为9. 5 %，茄尼醇的收率为60%。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
权利要求
1.一种双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤1)将干马铃薯叶粉碎后过40目 60目筛，加入蒸馏水，干马铃薯叶原料与蒸馏水的质量与体积比为20g IOOml 400ml，在超声波功率150 250W、频率40KHz、温度30°C 60°C条件下超声水洗20 60min，然后过滤得固体物质A ；2)向物质A中加入用pH4.0 5. 6的柠檬酸缓冲液配制的浓度为0. OOlg/ ml 0. 004g/ml的纤维素酶液，干马铃薯叶原料与所述纤维素酶液的质量体积比为 20g 100ml 300ml，在温度30°C 60°C、搅拌速度100 120r/min条件下酶解1 5 小时，并在3600 4000转/分钟条件下离心10 15min，然后弃除上清液得物质B ；3)向物质B中加入用pH7 9的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制的质量浓度为0. 001g/ml 0.006g/ml的脂肪酶液，干马铃薯叶原料与脂肪酶液的质量体积比为 20g 100ml 500ml，在温度30°C 60°C、搅拌速度100 120r/min条件下酶解1 5 小时，再在3600 4000转/分钟下离心10 15min，然后弃除上清液得物质C ；4)向物质C中加入95%乙醇，干马铃薯叶原料与95%乙醇的质量体积比为 20g 300ml 600ml，在微波频率2450MHz、功率为200 400W、温度30°C 60°C、搅拌速度60 lOOr/min条件下微波辅助回流提取1小时，将收集的提取液在0. OSMPa条件下抽滤，再将收集的滤液在0. OSMpa真空度，50°C条件下减压浓缩至粘稠状得茄尼醇粗制品D， 粗制品D中，所述茄尼醇的含量为15 19%，茄尼醇的收率为87% 92%。
2.根据权利要求1所述的双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法，其特征在于，所述马铃薯叶为陇薯6号马铃薯叶。
全文摘要
本发明公开了一种双酶偶联法辅助提取茄尼醇的方法。该方法利用纤维素酶改变马铃薯叶细胞壁的通透性，然后用脂肪酶水解结合态的茄尼醇，克服了传统工艺直接提取后接着纯化或试剂提取后用碱皂化导致茄尼醇降解或异构化，从而得率较低的缺点。
文档编号C12P7/02GK102154376SQ20101058921
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者张继, 杨玲娟, 王凤霞, 王自社, 袁毅君, 谢天助, 马君义 申请人:天水师范学院