专利名称：利用孕妇外周血建立胎儿dna文库的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用孕妇外周血建立胎儿DNA文 库的方法。
背景技术：
新生儿中有少部分存在先天性遗传病或出生缺陷，给社会和家庭带来巨大的经济 和精神负担。2007年中国有1564万新生儿出生，其中出生缺陷率超过1%。出生缺陷是影 响我国全民健康水平和人口素质的重要问题。国家“十一五”规划纲要将生殖健康相关技 术列为科技发展优先主题；2006-2020年国家中长期规划也将“出生缺陷防治”作为重点领 域和优先主题。我国每年约出生80 120万缺陷婴儿；造成经济损失约10亿元人民币。 遗传病是新生儿缺陷的最主要原因之一，而且许多先天性出生缺陷往往缺乏有效的治疗方 法，因此早期诊断和预防是目前降低出生缺陷的最有效措施。遗传缺陷的种类多，成因复杂。比如，其中由拷贝数的变化导致遗传缺陷的疾病包 括21号染色体三体综合症(唐氏综合症)，18号染色体三体综合症(爱德华综合症)；13 号染色体三体综合症(Patau综合征)等。其中由DNA甲基化或三核苷酸重复突变导致遗 传缺陷的疾病包括X染色体易损综合症(Fragile X)。其中由基因多态性导致遗传缺陷的 疾病包括年龄相关性黄斑变性，假性剥脱综合征和阿尔兹海默病。目前认为，对孕妇进行胎儿基因或染色体诊断是降低畸形儿出生率最为有效的办 法之一。现在世界上进行这类诊断通常是在孕期第16到18周间进行的，办法一是通过子 宫穿刺羊膜腔，从羊水中获取胚胎细胞，二是提取胎盘组织进行活体检查，但这两种办法都 比较复杂，且都是采用介入式方法进行，对孕妇和胎儿有可能引起一定的损伤，甚至有时会 引发宫内感染、羊膜破裂、流产、胎儿畸形或死亡等。由于其潜在的风险，此类诊断临床上一 般只针对高龄孕妇和有家族畸形遗传史的孕妇进行，其排查和检测的范围小，因此，也难以 对整个新生儿先天性遗传病或出生缺陷的产前诊断做出足够的贡献。目前，开发新的方便、安全的胎儿基因或染色体诊断技术是国内外相关领域的热 点领域。比如从外周血中获取或富集胚胎细胞用于胎儿遗传诊断近年来取得了一定的进 展。如法国国家卫生与医学研究所(INSERM)的科学家利用胚胎细胞比母体血液细胞大的 特点，尝试从孕妇的血液中分离出胚胎细胞，然后再通过分析母体和父体基因的遗传特性， 进行细胞筛选。对13名孕期为11到12周的 孕妇进行的诊断实验表明，这种细胞筛选法是 可行的，母体血液化验法在理论上可以替代羊膜腔穿刺术和胎盘活组织检查。但是其检查 不同胎儿畸形症状时的敏感性、可靠性还有待确认，且由于胚胎细胞数量少，对于检验仍然 存在较大的困难。本领域需要提供更方便、安全的非介入性胎儿基因或染色体诊断相关技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全、便捷、非介入式的自动化的可在芯片上直接完成的胎儿基因文库的建立方法。本发明解决该技术问题采用的技术方案是提供一种利用孕妇外周血建立胎儿的 DNA文库的方法。本发明方法包括以下步骤a、从孕妇的外周血液中提取DNA ；b、对DNA进行末端修复获得具有磷酸化平末端的DNA片段；c、在DNA片段3’端先添加互补的“A”碱基；d、使用接头序列修饰DNA片段的末端；e、扩增得到DNA文库。其中，上述方法步骤a从孕妇的外周血中提取DNA，提取量在1 5ng。优选使用 Qiagen公司的spin column进行。所述的孕妇外周血包括静脉血、动脉血或指尖采集的血 液均可。其中，上述方法步骤b通过使用T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段 (Klenow片段)和多核苷酸激酶T4，使DNA片段成磷酸化的平末端。其中，上述方法步骤c是在步骤b获得的DNA片段的3’端使用3’到5’外切酶活 性缺失了的Klenow片段添加互补的“A”碱基，以便得到3’端加上了单个“T”碱基突出端 的磷酸化的DNA片段的平末端。其中，上述方法步骤d是测序用接头序列与DNA片段的两端进行连接修饰；所述接 头序列为接头序列1接头序列Ia :5，ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3，SEQ ID No 1，接头序列Ib :3，TGTGAGAAAGGGATG TGCTGCGAGAAGGCTAGp 5，(按 5，端到 3，端为5，pGATCGGAAGAGCGTCGT GTAGGGAAAGAGTGT 3，，即 SEQ ID No 2,5'端的“P”表示5’端磷酸化)，接头序列2接头序列2a :5，pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3，SEQ ID No 3接头序列2b :3，TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5，。(按 5，端到 3，端为5，CAAGCAGAAGACGG CATACGAGCTCTTCCGATCT 3，BP SEQ ID
No 4)其中，上述方法步骤d是用PCR方法扩增接头序列修饰后的DNA片段，制得DNA文 库；所述的PCR扩增的引物对的序列为PCR 引物序歹Ij 1(SEQ ID No 5)5， AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3’ ；PCR引物序列2:3’ TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5，。(按 5，端至Ij 3，端为5，CAAGCAGAAGACGG CATACGAGCTCTTCCGATCT 3，，即 SEQ ID
No 6)。其中，上述方法中使用的孕妇的外周血为最早9孕周的外周血。如9孕周或9 到12孕周。
本发明还提供了上述方法所制备的胎儿DNA文库。本发明另外还提供了一种胎儿基因组序列分析的方法。该方法实是使用上述的方 法所制备的胎儿DNA文库进行测序分析，且测序引物序列为(SEQ ID No 7)5， ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3，。本发明的有益效果在于本发明方法能够快速、高效地从孕妇的外周血中建立离 体的DNA文库，并能实现自动化的建立过程，尽量避免人工操作可能带来的的错误和污染。 该文库中含有胎儿的基因组序列，并且每个DNA片段的两端连接有测序引物和连接接头， 能够方便地进行快速准确地测序，从而能准确地获得胎儿基因组序列数据，从而用于胎儿 的先天性遗传病或出生缺陷。使用本发明方法，能早在妊娠9周，就利用孕妇血液循环中游 离的DNA来建立胎儿的有效DNA文库，大为减轻后继处理带来的风险。建立的DNA文库能使 用测序仪很快产生测序分析得到检测报告，经试验证明，检测21号染色体三体综合征，13 三体综合征，18三体综合征等可以同时完成。且结果准确，无假阳性和无假阴性。并且检测 可以用于少量的离体外周血液样本，大大减轻了孕妇的痛苦和风险，具有很好的应用前景。
图1为本发明方法的流程简图。图2为本发明方法中加上接头序列后的DNA片段的结构示意图，同时示意表示接 头序列、测序引物及PCR引物间的关系。图3为构建的文库中的各个片段的结构以及接头序列、测序引物及PCR引物间图4为使用对使用本发明方法建立的7个胎儿样本DNA文库进行的测序诊断结 果。纵坐标表示为Z值；横坐标表示为1号 第22号染色体，以及X染色体。每个横坐标 的染色体号段内，从左到右依次为1 7号样本的结果。第1、2、3、4、5号样本为T21 (21号 染色体三倍体，此时软件显示的Z-值大于6)的情况，即会患有唐氏综合症。第6、7号的胎 儿样本的检测结果表明基因组是正常的整倍体；
具体实施例方式以下通过具体实施方式
，对本发明进行具体的说明。可自动化制备“孕妇血液中自由流动的胎儿DNA文库”的创新技术是在以前利用 柱子制备DNA文库技术上的改进技术，或者叫做“芯片实验室技术”。本发明开发了一项“芯片实验室”技术，该技术实现了 DNA文库制备的自动化。与 现有技术相比，本发明技术的优越性在于1.无需Meven Quake博士曾报道和利用过的 凝胶电泳及胶回收步骤(参考文献Fan et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 20080ctober 21 ； 105 (42) :16266-16271).凝胶电泳和胶回收步骤不仅易造成样品交叉污染，而且耗 时费力，整个过程不能实现自动化。2.由Dermis Lo和Rossa Chiu研究小组报道的利 用柱子制备 DNA 文库的技术(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008December 23 ；105(51) 20458-20463.)，虽可避免由凝胶电泳和胶回收方法导致的样品交叉污染，但其仍然耗时费 力，而且也不能自动化。然而，本发明的“芯片实验室”技术是应用芯片中的分离通道制备所有的DNA文 库，该步骤可完全自动化完成。与现有技术相比，本发明中所使用的技术的优越性在于1.不需要凝胶电泳和胶回收步骤，因此避免了样品交叉污染的可能性。2.由于从血浆DNA 提取到序列数据库制备的整个过程都是可在芯片上完成，只需一键操作，因此以本发明DNA 文库制备方法为基础的“芯片实验室”技术具有非常高的通量。如采用以前的方法，一个人 一天可处理4-8个文库。而利用自动化的“芯片实验室”，每台仪器一天至少可处理20-40 个文库。如有10台仪器，那么每天可处理200-400个文库，大大提高了处理效率和减少了 获得检测结果的时间。结合可用于分析Illumina测序仪HKeq2000测序结果的统计学软件。因此，就可 以构成一套完整的从孕妇血中进行无创伤检测唐氏综合征的软硬件综合系统，这在实际应 用中有很好的应用前景。更难能可贵的是，能早在第9孕周就获得准确的检测结果，具有重 要的意义。以下是“基于芯片实验室和下一代测序技术的无创伤检测唐氏综合征”的流程第一步从孕妇血液中提取DNA(1 5纳克)上样于“芯片实验室”，制备测序用文库。第二步上样于“下一代测序仪”(Illumina测序仪)，进行DNA测序分析。第三步对测序结果进行统计学分析，得到胎儿诊断结果是否患唐氏综合征。本发明要关注的主要是关键的第一步，及即准确快速、无污染且能自动化地建立 测序用文库的方法。设备贝克曼公司(Beckman Coulter, Inc.)芯片实验室SPRI-TE Instrumentcatalog #A50100, SPRIworks Fragment Library Kit I catalog # A84803。实施例一使用本发明方法建立基因文库一、DNA 的获取从孕妇的离体外周血液中提取的DNA片段。获取孕妇的离体外周血浆，使用试剂盒QIAamp DNA Midi reagent set(Qiagen，德 国，catlog # 51183)提取血浆中的游离DNA，方法是使用该试剂盒中的血液和体液处理方 法(〃 blood and body fluid" protocol)。DNA 的纯化过程使用 the QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒自动进行在QIAcube (QiaRen 9001292)上进行，此步骤可通过这些试剂盒 自动完成。二、末端修复从孕妇的血液中提取的DNA是双链DNA片段，这些片段是平端的，或含有3或5’ 突出端。这一步是通过T4DNA聚合酶，大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，和多 核苷酸激酶T4，使突出端磷酸化成平末端。3’到5’外切酶活性去除3’突出端，聚合酶活 性填充5’突出端。Sambrook等(1989)对这一步过程做了更详细的解释。重要的是这种方 法采用了大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)，而不是用步骤三使用的缺失了 3’ 到5’外切酶活性的Klenow片段。材料从血浆DNA 中提取 DNA (DNA 1 至 5ng，30 μ 1 水)。T4DNA连接酶缓冲液与IOmM ΑΤΡ。dNTPs 的混合物(IOmM)。T4DNA 聚合酶(3 单位 / μ 1)。
Klenow 片段(5 单位 / μ 1)。Τ4ΡΝΚ (Τ4多核苷酸激酶，10单位/ μ 1)，QIAquick PCR扩增纯化试剂盒OiIAGEN 公司，目录编号#28104)。程序1、以1 5的比例，用水稀释lU/ul浓度的DNA偶合聚合酶。2、准备以下反应的组合IOng 血浆 DNA 的 DNA30 μ 1/K10 μ 1含IOmM ATP的T4DNA连接酶缓冲液5 μ 1含IOmM dNTPs的T4DNA连接酶缓冲液2 μ 1T4DNA 聚合酶1 μ 1Klenow 片段(稀释为 lU/ul)1 μ 1Τ4ΡΝΚ1 μ 1_共有50 μ 13、在PCR仪保持30分钟，温度20 V。4、纯化——按照MinElute PCR纯化试剂盒和方法，用QIAquick MinElute柱进行 纯化，用34 μ 1的洗脱缓冲液EB(Elution Buffer)洗脱。三、具有加了 “A”碱基的3’端的DNA片段的获取接头序列需要连接到在3’端加上了单个“T”碱基突出端的磷酸化的DNA片段的 平末端。要进行这一连接，需要先在第一步获得的DNA模板片段的3’端先添加互补的“A” 碱基。而这需要使用缺失了 3’到5’外切酶活性的Klenow片段来完成。材料第二步获得的DNACM μ 1)Klenow 缓冲液(IOX)dATP (ImM)Klenow片段(缺失3’到5’外切酶活性)(5单位/ μ 1)PCR 仪MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN天根公司，目录编号#28004)。这一步使用的是Qiaquick MinElute柱，而不是普通的Qiaquick柱。程序1、准备以下反应的体系从第1 步的 DNA34 μ 1Klenow 缓冲液5μ 1dATP10 μ 1Klenow片段(缺失3’到5’外切酶活性)1 μ 1_共有50 μ 12、在37°C孵育30分钟。
3、纯化——按照MinElute PCR纯化试剂盒和方法，用QIAquick MinElute柱进行 纯化，用
0100]10 μ 1的洗脱缓冲液洗脱。
0101]四、接头与DNA片段的两端进行连接
0102]连接反应需要接头序列
0103]接头序列1
0104]接头序列Ia 5，ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT3，
0105]接头序列Ib 3，TGTGAGAAAGGGATG TGCTGCGAGAAGGCTAGp 5，
0106]接头序列2
0107]接头序列2a 5，pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3，
0108]接头序列2b 3，TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5，
0109]另外还需要PCR用的引物序列以及DNA测序所使用的引物序列
0110]PCR引物序列1:
0111]5， AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'
0112]PCR引物序列2:
0113]3' TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5'
0114]ij ；!5弓L·歹[J (Genomic DNA Sequencing Primer),
0115]5， ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3，
0116]接头序列、PCR引物、测序引物之间的关系及在文库构建中的作用可直观的参见图 和图3
0117]材料
0118]第三步处理后的DNA(10 μ 1)；
0119]DNA连接酶缓冲液QX)；
0120]接头序列1和2等比混合物；
0121]DNA连接酶(1单位/μ 1)
0122]QIAquick PCR扩增纯化试剂盒OiIAGEN公司，目录编号#28104)
0123]其中购自Illumina的接头序列混合使用前用1 10比例稀释，以适应本方法中 较小量的DNA。
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
程序
1、准备以下反应的体系 第三步的处理后的DNA DNA连接酶缓冲液 接头序列混合物(1 10稀释) DNA连接酶
10 μ 1 15μ 1 1 μ 1
4μ 1
共有30 μ 1
2、室温，孵育15分钟。
3、纯化——按照MinElutePCR纯化试剂盒和其说明书的方法，用QIAquick
MinElute柱进行纯化，用30 μ 1的洗脱缓冲液EB洗脱。
五、将修饰后的DNA片段与PCR扩增接头序列进行将接头序列修饰的DNA 23/30 μ 1添加到PCR仪进行扩增制备文库。使用15次 PCR循环以确保凝胶纯化步骤有足够的产量。材料用MinElute PCR纯化试剂盒OiIAGEN公司，目录编号#28004)第四步处理后的DNA (30 μ 1)。水。试剂盒含的2 X PCR扩增用Master混合物。PCR引物序列15， AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'；PCR引物序列23’ TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5，。PCR 仪。程序1、准备以下PCR反应的体系DNA23 μ 1Phusion DNA 聚合酶25 μ 1PCR 引物 1Ιμ PCR 引物 21 μ 1_共有50 μ 12、按以下方法进行PCR技术扩增30 秒至 98 °C;然后[98°C，10秒；65°C，30 秒；72°C，30 秒]个循环；然后5 分钟，72 °C;然后将产物保存于4°C。3、纯化——按照MinElute PCR纯化试剂盒和其说明书的方法，用QIAquick MinElute柱进行产物的纯化，用10 μ 1的洗脱缓冲液EB洗脱。制备得到DNA文库，保存待用。用上述的构建文库的方法，结合可用于分析Illumina测序仪Hikq2000测序结果 的统计学软件，就可以构成一套完整的从孕妇血中进行无创伤检测唐氏综合征的软硬件综 合系统，这在实际应用中有很好的应用前景。以下是“基于芯片实验室和下一代测序技术的无创伤检测唐氏综合征”的流程第一步从孕妇血液中提取DNA (1 5ng)上样于“芯片实验室”，制备测序用文库。第二步上样于“下一代测序仪”(Illumina测序仪)，进行DNA测序分析。第三步对测序结果进行统计学分析，得到胎儿诊断结果是否患唐氏综合征。本发明要关注的主要是关键的第一步，及即准确快速、无污染且能自动化地建立 测序用文库的方法。实施例二使用本发明方法建立的基因文库测序进行产前诊断试验方法
获取7个孕妇的9孕周的离体血浆(为保护孕妇及胎儿的隐私，孕妇的私人信 息不便给出)，利用实施例一的方法在贝克曼公司(Beckman Coulter, Inc.)的芯片实验 室上构建各个胎儿的DNA文库，然后将DNA文库上样于Illumina测序仪，使用测序引物 5，ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT3，进行DNA测序分析，获得测序的统计分析结果， 即序列分析统计软件得出的每个DNA文库的对应各染色体(包括第1号 第22号染色体， 以及X染色体)的Z值。试验结果测序实验结果见图4，图4可见各个样本的各条染色体的Z-值 (Z-score)，第6、7号的胎儿样本的检测结果表明基因组是正常的整倍体；而第1、2、3、4、5 号样本为T21(21号染色体三倍体，此时软件显示的Z-值大于6)的情况，即会患有唐氏综合症。经过胎儿出生后进行验证，表明上述的关于21号染色体的分析结果是完全正确 的。
权利要求
1.一种利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于包括以下步骤a、从孕妇的外周血液中提取DNA；b、对DNA进行末端修复获得具有磷酸化平末端的DNA片段；C、在DNA片段3，端先添加互补的“A”碱基；d、使用接头序列修饰DNA片段的末端；e、扩增得到DNA文库。
2.根据权利要求1所述的利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于 所述步骤a从孕妇的外周血中提取DNA提取量在1 5ng。
3.根据权利要求1所述的利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于 所述步骤b通过使用T4DNA聚合酶、大肠杆菌DNA多聚酶I大片段(Klenow片段)和多核 苷酸激酶T4，使DNA片段成磷酸化的平末端。3.根据权利要求1所述的利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于所 述步骤c是在步骤b获得的DNA片段的3’端使用3’到5’外切酶活性缺失的Klenow片段 添加互补的“A”碱基，以得到3’端加上了单个“T”碱基突出端的磷酸化的DNA片段的平末 端。
4.根据权利要求1所述的利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于 所述步骤d是测序用接头序列与DNA片段的两端进行连接；接头序列为接头序列1 接头序列 Ia :5，ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3，接头序列 Ib :3’ TGTGAGAAAGGGATG TGCTGCGAGAAGGCTAGp 5’ ；接头序列2 接头序列 2a :5，pGATCGGAAGAGCTCGTATG CCGTCTTCTGCTTG 3，接头序列 2b :3，TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5，。
5.根据权利要求1所述的利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法，其特征在于 所述步骤d是用PCR方法扩增接头序列修饰后的DNA片段，制得DNA文库；所述的PCR扩增 的引物对的序列为PCR引物序列15' AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3'PCR引物序列23’ TCTAGCCTTCTCGAGCATAC GGCAGAAGACGAAC 5’。
6.利用权利要求1 5任一项所述的方法所制备的胎儿DNA文库。
7.胎儿基因组序列分析的方法，其特征在于使用权利要求1 5任一项所述的方法 所制备的胎儿DNA文库进行测序分析，且测序引物序列为`5， ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT 3，。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用孕妇外周血建立胎儿DNA文库的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种安全、便捷、非介入式的胎儿基因文库的建立方法。本发明技术方案是提供一种利用孕妇外周血建立胎儿的DNA文库的方法a、从孕妇的血液中提取DNA(1～5ng)，b、对DNA进行末端修复获得具有磷酸化平末端的DNA片段；c、在DNA片段3′端先添加互补的“A”碱基；d、使用接头序列修饰DNA片段的末端；e、扩增得到DNA文库。使用本发明方法，能早在妊娠9周，就利用母体血液循环中游离的DNA来建立胎儿的有效DNA文库，用于产前诊断，尤其可以直接地用于自动化的芯片检测系统使用，具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102127818SQ201010589408
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者张康, 高远 申请人:张康