专利名称：一种具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌及其在水稻稻瘟病防治中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有防治水稻稻瘟病微生物材料及其在水稻稻瘟病防治中的用途。
背景技术：
水稻稻瘟病是一种严重的真菌病害，其危害造成产量减产10% 20%，严重的可达40% 50%。20世纪90年代以来，我国该病的每年发生面积均在8000万亩以上，年损失稻谷达数亿公斤。国内目前防治稻瘟病主要是通过化学防治来控制，但化学农药一直存在着耐药性、污染环境、农药残留、生物多样性降低、人畜毒害等诸多无法克服的弊端。目前我国农作物的化学农药用量超过1000kg/km2，土壤残留达到量为50% 60%，农作物中农药总检出率为20% 45%，既制约了农药行业的可持续发展，也对我国的食品安全和环境保护构成了威胁。随着社会的发展，人们越来越认识到使用化学农药是以牺牲生态环境和人类健康为代价而获取效益的。人是自然的组成部分，只能与自然协调共存。所以，人类需求以生物防治为主的综合治理措施来防治病虫害，以实现全球农业的可持续发展。水稻稻瘟病的生物防治是从20世纪50年代开始的，70年代初首先在美国、日本、俄罗斯等国家广泛开展了综合防治的理论和应用研究。我国从20世纪80年代开始进行稻瘟病的微生物农药研制以来，近年来取得了一些成果穆常青等研究发现枯草芽孢杆菌B-332菌株能够在水稻叶面上有效定殖达21天以上；田间试验结果表明，芽孢浓度在
1X 108CfU/ml时，该菌株对水稻穗颈瘟的防治效果达57. 2%，增产率达9. 6%。彭好文等研究发现芽孢杆菌Bll的拮抗蛋白粗提液对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、生菜菌核病菌和水稻稻瘟病菌等10种病菌均有有较强的拮抗作用，其抑菌机制主要使病菌菌丝畸形，细胞质浓缩，孢子不萌发或萌发异常。但是，这些研究都只停留在试验和推广阶段。
发明内容
本发明提供了一种具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌及其在水稻稻瘟病防治中的用途。具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5742。如上所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO属于枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10为革兰氏阳性菌，杆状，长为1. 5
2μ m、宽为0. 5 1 μ m，有芽孢(如图1所示)；菌落呈乳白色，皱褶，边缘不整齐，菌落中心突起呈脊状(如图2所示)。
本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO对水稻稻瘟病有防治作用，对水稻稻瘟病防治达60% 80%;枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO是从自然界中分离获得的，对人畜无毒、无害；对环境不造成污染，不伤害非靶标生物；水稻籽粒中无农药残留；不会诱发病原菌或病虫的抗药性；在农业生产中的广泛应用，可产生巨大的经济效益。本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10可在温度为20 40°C、pH值为 6. 0 8. 0的环境中生长，并能在水稻植株体内定殖。本发明具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10，属于枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年02月07日，保藏号为CGMCC No. 5742。
图1是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO的菌体显微镜观察图。图2是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的菌落观察图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 5742。本实施方式枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO是从水稻的根部组织中分离得到的。其分离方法如下一、从农垦科学院水稻试验田中采集水稻植株(品种为垦稻11)，用水冲洗干净， 称取根Ig作为供试材料，用体积浓度为70%的酒精和体积浓度为0. 氯化汞对供试材料表面消毒，杀灭供试材料表面微生物；二、在无菌环境中，供试材料用无菌水冲洗液三次，晾干后转入无菌研钵中研磨碾碎；三、向供试材料分别加IOml无菌水勻浆，静止15min后，各取100 μ 1涂于NYDA培养基上，置于30°C暗室培养48h ；四、挑取步骤三长出的单菌落，在 NYDA培养基上反复划线纯化，直至得到纯系单菌落为止；五、将纯系单菌落接种于NYD液体培养基中，在30°C暗室培养12h，然后取菌液700 μ 1加入体积浓度为15%的30 μ 1甘油中， 混合后，置于_70°C冷冻保存。本实施方式中NYDA培养基由酵母膏5g、牛肉膏Sg、葡萄糖10g、琼脂17 20g和 IOOOml蒸馏水组成。NYD液体培养基由酵母膏5g、牛肉膏Sg、全糖粉IOg和IOOOml蒸馏水组成。本实施方式枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10具有运动性。本实施方式枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10无可溶性色素、甘露醇发酵为阳性、葡萄糖发酵为阳性、形成芽孢试验为阳性、阿拉伯糖发酵为阳性、形成伴胞晶体试验为阴性、淀粉水解试验为阳性、V-P试验为阳性、接触酶试验为阳性、质量浓度7%的NaCl 耐盐性试验为阳性、利用柠檬酸盐试验为阳性、氧化酶试验为阳性、硝酸盐还原试验为阳性、庆氧生长试验为阳性、明胶液化试验为阳性、分解酪素试验为阳性、M-R试验为阳性、产酸试验为阳性、酪氨酸水解试验为阴性。将本实施方式的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10接种于pH值为6. 0 8. 0的营养肉汤培养基中，在20 40°C条件下富集培养至菌落浓度达3X 109cfu/ml。
具体实施方式
二 本实施方式具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10在水稻稻瘟病防治中的用途。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是将含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的生物农药用水稀释100倍喷洒于水稻叶面。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二或三的不同点是含有枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10 的生物农药中枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10 的菌落浓度为20 40亿个/毫升。其它步骤及参数与实施方式二或三相同。本实施方式含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的生物农药用水稀释 100倍喷洒于水稻叶面，对水稻稻瘟病防治达60% 80% .具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二至四之一的不同点是含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的生物农药按以下步骤制备一、菌种活化将_70°C甘油中保存的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10 划线接种于NYDA培养基，在温度为37°C 士 1°C恒温箱中培养12h，然后挑取单菌落接种于 5ml的NYD液体培养基中，在温度为37°C 士 1°C环境、频率为150r/min条件下振荡培养18 20h ；二、菌种培养取0. Iml枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10菌液接种于1 升的NYD液体培养基上，在温度为37°C恒温箱中培养18 20h ；三、发酵将经过步骤二菌种培养的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10培养液接种于NYD液体培养基，接种量为NYD液体培养基体积的0. 5%，接种后控制发酵温度在37士0. 5°C，发酵时间30 48h，搅拌速度为150r/min，发酵罐内气压为0. 5个大气压，发酵初始通气量为0. 8VVM，发酵开始几后至发酵结束通气量为1VVM，发酵结束发酵液中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的菌落浓度为20 40亿个/毫升，即得到含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的生物农药。其它步骤及参数与实施方式二至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
二至五之一的不同点是步骤三中发酵罐内NYD液体培养基为700 750L。其它步骤及参数与实施方式二至五之一相同。实施例1试验地设在五常县一农户试验田，水稻品种为松粳12号。待水稻秧苗长到分孽期时，分别采用人工喷雾接种法进行接种试验。稻瘟病菌分生孢子悬浮液浓度为IXlO5 孢子/ml，且孢子萌发率在95%以上。具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌枯草芽孢杆菌 BacilIus subtilis Bsw-10的悬浮液浓度为2. 8 X 107cfu/ml。并在枯草芽孢杆菌Baci 1 Ius subtilis Bsw-IO的悬浮液及稻瘟病菌分生孢子悬浮液中加入0. 2%的吐温20。处理方法1 将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的悬浮液喷雾接种水稻叶面，24h之后接种稻瘟病菌分生孢子悬浮液。处理方法2 稻瘟病菌分生孢子悬浮液喷雾接种，24h之后对叶面喷雾枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10 的悬浮液。每个处理实验区面积为0. 5亩，并设置只喷病菌孢子悬液为对照组。接种后8天调查，每小区5点取样，每点调查50片叶，计算病情指数和防效。试验结果如表1所示，试验结果表明，芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10对水稻稻瘟病的防治效果显著，两个处理的病情指数明显低于对照组，防治效果分别为78.6% 和70. 2%，处理方法1防效好于处理方法2。表 权利要求
1.一种具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌，其为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5742。
2.如权利要求1所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途。
3.如权利要求2所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途，其特征在于将含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO的生物农药用水稀释100 倍喷洒于水稻叶面。
4.如权利要求3所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途，其特征在于含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-IO的生物农药中枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10的菌落浓度为20 40亿个/毫升。
5.如权利要求4所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途，其特征在于含有枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的生物农药按以下步骤制备一、菌种活化将_70°C甘油中保存的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis Bsw-10划线接种于NYDA培养基，在温度为37°C 士 1°C恒温箱中培养12h，然后挑取单菌落接种于5ml的 NYD液体培养基中，在温度为37°C 士 1°C环境、频率为150r/min条件下振荡培养18 20h ；二、菌种培养取0.Iml枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10菌液接种于1升的 NYD液体培养基上，在温度为37°C恒温箱中培养18 20h ；三、发酵将经过步骤二菌种培养的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis Bsw-10培养液接种于NYD液体培养基，接种量为NYD液体培养基体积的0. 5%，接种后控制发酵温度在 37士0. 5°C，发酵时间30 48h，搅拌速度为150r/min，发酵罐内气压为0. 5个大气压，发酵初始通气量为0. 8VVM，发酵开始几后至发酵结束通气量为1VVM，发酵结束发酵液中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10的菌落浓度为20 40亿/毫升，即得到含有枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis Bsw-10 的生物农药。
6.如权利要求5所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途，其特征在于步骤三中发酵罐内NYD液体培养基为700 750L。
全文摘要
一种具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌及其在水稻稻瘟病防治中的用途，涉及一种具有防治水稻稻瘟病微生物材料及其在水稻稻瘟病防治中的用途。具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Bsw-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5742。所述的具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细在水稻稻瘟病防治中的用途。本发明用于生物防治水稻稻瘟病。
文档编号C12R1/125GK102559562SQ20121004987
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者孟利强, 张云湖, 张先成, 张淑梅, 曹旭, 李晶, 王玉霞, 赵晓宇 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所