专利名称：哈氏噬纤维菌的电转化方法
技术领域：
本发明涉及一种电转化方法，特别是一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，属于生物技术领域。
背景技术：
哈氏曬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)是一类好氧的能够彻底降解结晶纤维素的革兰氏阴性细菌，土壤当中广泛存在，属于噬纤维拟杆菌属。由于哈氏噬纤维菌不含有类似厌氧纤维素降解细菌的纤维小体的结构，而且也不分泌游离的纤维素酶，所以其新型的纤维素降解机制到目前为止仍未得到阐明。因其能彻底地降解结晶纤维素，在促进纤维素生物能源转化利用方面具有潜在的应用前景。鉴于其独特的纤维素降解机理及良好的应用前景，对于其进行分子水平的功能研究就显的极为重要，这对于进一步阐释其纤维素降解机制来说是必要的，而哈氏噬纤维菌的高效转化则是实现基因功能研究的必要手段。目前，哈氏噬纤维菌的遗传转化经常采用接合转化的方法来完成外源基因的导入，如MARK J. McBRIDE等人通过Tn4351转座的方法得到了突变子，但该方法操作复杂、转化效率低，不稳定且重复性较差，所以寻找新的转化方法是完成哈氏噬纤维菌遗传操作的必要前提。电转化法由于具有操作简单、转化效率高等优点被广泛应用于多种微生物，但对于哈氏噬纤维菌来说，由于其培养条件特殊、细胞表面结构含有粘多糖等特点，电转化较难完成，在国内外则鲜有报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种哈氏噬纤维菌的电转化方法。该方法通过对哈氏菌的培养条件、生长状态、电击缓冲液、电场强度、质粒浓度、复苏时间等因素进行优化，得到电转化的最优条件并提高了电转化效率。本发明是通过如下技术方案实现的一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，步骤如下(I)制备外源DNA质粒，获得浓度大于40 U g/ml的重组质粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的终浓度为8mM，甘油体积占溶液总体积的10%，将上述水溶液置于冰浴中，制得电击缓冲液；(3)将菌种保藏号为ATCC NO. 33406的哈氏噬纤维菌菌体在液体培养基TY2中培养活化，170rpm，30°C培养35_50h，再转接TY2液体培养基中培养，170rpm，30°C培养 35-50h，然后，离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，离心；再用步骤(2)制得的电击缓冲液洗涤重悬细胞1-2次，离心；最后用电击缓冲液重悬细胞，制得感受态细胞；(4)将步骤(3)制得的感受态细胞在14KV/cm、400 Q>25uF的条件下电击4_6ms， 然后转入液体培养基TY2，170rpm，30°C复苏培养12-16小时，在含有30 y g/ml红霉素的固体平板培养基TY2上筛选转化子，制得电转化后的哈氏噬纤维菌。所述步骤(I)中的外源DNA质粒为质粒pEP4351。所述步骤(3)和步骤(4)中的液体培养基TY2，每升组分如下蛋白胨2g,酵母浸出物0. 5g,葡萄糖2g,纯水定容至1L, pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。所述步骤(3)的离心条件为4°C、7000rpm、5min。所述步骤(3)的转接量为1% (v/v);培养时间为40h ;最后用100-200倍的电击缓冲液重悬细胞，_70°C冻存。所述步骤⑷中液体培养基TY2的温度为30°C。提前预冷的液体培养基TY2，可以在一定程度上对受损的细胞加以保护，减少致死率。所述步骤(4)中固体平板培养基TY2，每升组分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，琼脂10g，纯水定容至1L，pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。有益效果I、本发明通过研究不同影响因素对哈氏噬纤维菌转化效率的影响，优化电转化参数，使外源DNA能利用电转化方法导入哈氏噬纤维菌，最终在筛选平板上可以得到较多转化子菌落，转化效率达到5 X IO4/ u g DNA。2、本发明在电击缓冲液中添加MgCl2，通过去除哈氏噬纤维菌细胞表面的粘多糖成分，使外源DNA更容易进入哈氏噬纤维菌，从而提高转化效率2-3倍。3、本发明通过降低加入筛选培养基的温度，对受损的细胞加以保护，减少致死率。4、本发明可以弥补目前使用的接合转化方法的不足，为哈氏噬纤维菌的遗传操作系统及分子生物学研究提供一种了方便、快速的途径。
图I为不同电场强度对转化效率的影响；图2为添加MgCl2对转化效率的影响；图3为复苏培养时加入培养基的温度对转化效率的影响；
具体实施方案下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中所述哈氏噬纤维菌购自美国标准生物品收藏中心，菌种保藏号 ATCCN0. 33406。实施例I一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，步骤如下(I)用 Takara Plasmid Purification Kit 于 E.coli S17-1 A pir BW19851 菌株中提取质粒 pEP4351(A J COOPER 等人构建，见 J. Bacteriol. 1997,179(20) :6221)，利用分光光度计测定质粒浓度为40 u g/ml重组质粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的终浓度为8mM，甘油体积占溶液总体积的10%，将上述水溶液置于冰浴中，制得电击缓冲液；
(3)将哈氏噬纤维菌菌体在液体培养基TY2中培养活化，170rpm, 30°C培养40h，再转接到液体培养基TY2液体培养基中，170rpm, 30°C培养40h，然后，7000rpm，5min, 4°C离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，7000rpm, 5min, 4°C离心收集细胞沉淀，弃上清以除去培养基中的杂质；用预冷的电击缓冲液洗涤重悬细胞2次，7000rpm，5min，4°C离心收集细胞，最后用100倍的电击缓冲液重悬细胞，制得感受态细胞后分装，_70°C冻存待用，制得感受态细胞；(4)从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；将装有质粒的I. 5m的离心管与1_的电击杯以及含有卡那霉素的液体培养基TY2(含有终浓度为5ug/ml的卡那霉素) 置于冰上预冷；取IOul的pEP4351质粒加入90ul的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，然后将混合物转移至已经预冷的电击杯中，冰上放置约IOmin ;打开电转化仪，调节参数为14KV/ cm、400Q、25ii F将电击杯放进电转化仪卡槽中，电击5ms，向电击杯中加入lml、0°C的液体培养基TY2 ;将菌液转入摇管中，再加入2ml液体培养基TY2，30°C，170rpm，复苏培养14小时；离心收集细胞，涂布含30 u g/ml红霉素的固体平板培养基TY2上，培养7天，观察结果， 筛选阳性转化子，同时设置不加质粒或不电击的感受态细胞作为阴性对照涂布抗性平板， 阳性转化子即为电转化后的哈氏噬纤维菌。液体培养基TY2，每升组分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，纯水定容至1L，pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。固体平板培养基TY2，每升组分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，琼脂10g，纯水定容至1L，pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。转化子数=菌落数X稀释倍数X转化实验原液总体积/涂板菌液体积=2 X IO4转化效率=转化子数/ U g DNA = 2 X 104/0. 4u g DNA = 5 X IO4/ U g DNA经检测，转化效率达到5 X IO4/ ii g DNA。实施例2不同电场强度对哈氏噬纤维菌电转化效率影响的实验实验采用哈氏噬纤维菌ATCC 33406菌株，质粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度计准确测定质粒浓度为40 ii g/ml。电击缓冲液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上预冷。将对数期的哈氏噬纤维菌ATCC 33406接种于液体培养基TY2中，170rpm，30°C 振荡培养40h，7000rpm, 5min，4°C离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，7000rpm, 5min，4 °C离心收集细胞沉淀，弃上清以除去培养基中的杂质；用预冷的电击缓冲液洗涤重悬细胞2次，7000rpm，5min，4°C离心收集细胞，最后用电击缓冲液重悬细胞，浓缩比例为 I 200，制得感受态细胞后分装，-70°C冻存待用。从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；将装有质粒的I. 5m的离心管与 Imm的电击杯以及TY2液体(含有终浓度为5ug/ml的卡那霉素)置于冰上预冷；取IOul的 PEP4351质粒加入90ul的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，然后将混合物转移至已经预冷的电击杯中，冰上放置约IOmin ;设置不同的电场强度参数，以考察电压对转化效率的影响， 电阻设置为400 Q，电容25ii F ;用吸水纸将电击杯外壁上的冰水擦干，立即放进电转化仪卡槽中，电击5ms，向电击杯中加入lml、0°C的液体培养基TY2 ;将菌液转入摇管中，再加入 2ml液体培养基TY2，30°C，170rpm，复苏培养16小时；离心收集细胞，涂布含30ug/ml红霉素的TY2固体平板上，培养7天，观察结果，对不同电压得到的阳性转化子进行计数，计算并比较不同电压的转化效率。同时设置不加质粒或不电击的感受态细胞作为阴性对照涂布抗性平板。对于不同电压来说，其对转化效率的影响是比较显著的，一方面如果电压太低，对细胞膜的穿透能力较弱难以形成外源DNA进入细胞的孔道，会使最终转化效率降低；另一方面倘若电压过大，又会致使感受态细胞受到电脉冲的冲击太大，降低细胞的存活率，进而影响转化克隆的产生。本实验结果见图1，从图中可以发现，随着电压的升高电转化效率也逐渐升高，当电压达到14KV/cm时，转化效率达到最高，随后又随电压的升高而降低。实施例3不同MgCl2浓度对哈氏噬纤维菌电转化效率影响的实验实验采用哈氏噬纤维菌ATCC 33406菌株，质粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E.coli S17-1入pir BW19851菌株，利用分光光度计准确测定质粒浓度为40 ii g/ml。电击缓冲液成分为含有不同浓度MgCl2的10%的甘油溶液，目的是确定最优的 MgCl2浓度，电击缓冲液在冰上冷冻保存。将对数期的哈氏噬纤维菌ATCC 33406接种于液体培养基TY2中，170rpm，30°C 振荡培养4011，7000印111，51^11，41离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，7000rpm， 5min，4°C离心收集细胞沉淀，弃上清以除去培养基中的杂质；用预冷的含不同浓度MgCl2的电击缓冲液洗涤重悬细胞2次，7000rpm，5min，4°C离心收集细胞，最后用相应的电击缓冲液重悬细胞，浓缩比例为I : 200，制得感受态细胞后分装，-70°C冻存待用。从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；将装有质粒的I. 5m的离心管与 Imm的电击杯以及TY2液体(含有终浓度为5ug/ml的卡那霉素)置于冰上预冷；取IOul 的pEP4351质粒加入90ul的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，然后将混合物转移至已经预冷的电击杯中，冰上放置约IOmin ;打开电转化仪，调节参数为14KV/cm、400Q、25iiF，将电击杯放进电转化仪卡槽中，电击5ms，向电击杯中加入lml、0°C的液体培养基TY2 ;将菌液转入摇管中，再加入2ml液体培养基TY2，30°C，170rpm，复苏培养16小时；离心收集细胞，涂布含30ug/ml红霉素的TY2固体平板上，培养7天，观察结果，对由含不同浓度MgCl2的电击缓冲液制备的感受态所得到的阳性转化子进行计数，计算并比较不同浓度的MgCl2对转化效率的影响。同时设置不加质粒或不电击的感受态细胞作为阴性对照涂布抗性平板。由于在哈氏噬纤维菌的细胞表面存在多糖类的粘性物质，这对电击转化来说是不利的，在电击缓冲液中加入MgCl2,能够有效去除其细胞表面粘多糖，实施例验证了不同 MgCl2浓度对电转化效率的影响，实验结果见图2。MgCl2浓度过大会使体系中的离子浓度升高，易引发爆杯现象从而降低转化效率，当MgCl2的浓度为8mM时,效果最佳。实施例4复苏培养时不同加入培养基的温度对哈氏曬纤维菌电转化效率影响的实验实验采用哈氏噬纤维菌ATCC 33406菌株，质粒pEP4351用Takara Plasmid Purification Kit提取于E. coli S17-1入pirBW19851菌株，利用分光光度计准确测定质粒浓度为40 ii g/ml。电击缓冲液配方如下10%甘油、8mM MgCl2，使用前在冰上预冷。将对数期的哈氏噬纤维菌ATCC 33406接种于液体培养基TY2中，170rpm，30°C 振荡培养4011，7000印111，51^11，41离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，7000rpm， 5min，4 °C离心收集细胞沉淀，弃上清以除去培养基中的杂质；用预冷的电击缓冲液洗涤重悬细胞2次，7000rpm, 5min，4°C离心收集细胞，最后用电击缓冲液重悬细胞，浓缩比例为 I 200，制得感受态细胞后分装，-70°C冻存待用。从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；将装有质粒的I. 5m的离心管与 Imm的电击杯以及TY2液体(含有终浓度为5ug/ml的卡那霉素)置于冰上预冷；取IOul 的pEP4351质粒加入90ul的感受态细胞中，轻轻吹打混匀，然后将混合物转移至已经预冷的电击杯中，冰上放置约IOmin ;打开电转化仪，调节参数为14KV/cm、400Q、25iiF，将电击杯放进电转化仪卡槽中，电击5ms，向电击杯中加入Iml不同温度的液体复苏培养基TY2 ； 将菌液转入摇管中，再加入2ml30°C的液体培养基TY2，30°C，170rpm，复苏培养16小时；离心收集细胞，涂布含30ug/ml红霉素的TY2固体平板上，培养7天，观察结果，计算阳性转化子数并比较不同复苏培养基加入温度对转化效率的影响，实验结果见图3。同时设置不加质粒或不电击的感受态细胞作为阴性对照涂布抗性平板。电击过程会放出热量，在一定程度上会影响感受态的活性，同时会使细胞受损，电击后立即加入低温的复苏培养基会对受损细胞予以保护并降低由电击所导致的细胞致死率，最终提高电转化效率。
权利要求
1.一种哈氏噬纤维菌的电转化方法，其特征在于，步骤如下(1)制备外源DNA质粒，获得浓度大于40μ g/ml的重组质粒溶液；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，MgCl2的终浓度为8mM，甘油体积占溶液总体积的 10 %，将上述水溶液置于冰浴中，制得电击缓冲液；(3)将菌种保藏号为ATCCNO. 33406的哈氏噬纤维菌菌体在液体培养基TY2中培养活化，170rpm，30°C培养35_50h，再转接TY2液体培养基中培养，170rpm，30°C培养35_50h，然后，离心收集细胞；用预冷的无菌水洗涤重悬细胞，离心；再用步骤(2)制得的电击缓冲液洗涤重悬细胞1-2次，离心；最后用电击缓冲液重悬细胞，制得感受态细胞；(4)将步骤(3)制得的感受态细胞在14KV/cm、400Ω、25 μ F的条件下电击4-6ms，然后转入液体培养基TY2，170rpm，30°C复苏培养12-16小时，在含有30 μ g/ml红霉素的固体平板培养基TY2上筛选转化子，制得电转化后的哈氏噬纤维菌。
2.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(I)中的外源DNA质粒为质粒 PEP4351。
3.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中的液体培养基TY2，每升组分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，纯水定容至lL，pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。
4.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(3)的离心条件为4°C、 7000rpm、5mino
5.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(3)的转接量为1%(v/v)； 培养时间为40h ;最后用100-200倍的电击缓冲液重悬细胞，_70°C冻存。
6.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(4)中液体培养基TY2的温度为30。。。
7.如权利要求I所述的电转化方法，其特征在于，所述步骤(4)中固体平板培养基 TY2，每升组分如下蛋白胨2g，酵母浸出物0. 5g，葡萄糖2g，琼脂10g，纯水定容至1L，pH 7. 2 ;高压蒸汽灭菌。
全文摘要
本发明涉及一种电转化方法，步骤如下(1)制备外源DNA质粒；(2)配制含有MgCl2和甘油的水溶液，将上述水溶液置于冰浴中，制得电击缓冲液；(3)将菌种保藏号为ATCCNO.33406的哈氏噬纤维菌菌体制备感受态细胞；(4)电击，然后转入液体培养基TY2复苏培养，在含有红霉素的固体平板培养基TY2上筛选转化子，制得电转化后的哈氏噬纤维菌。
文档编号C12N15/63GK102586305SQ20121004977
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者卢雪梅, 季晓飞, 张为灿, 徐元喜, 李鹏伟 申请人:山东大学