一种防治枸杞根腐病制剂及制备、使用方法与流程

本发明涉及植物根腐病防治技术领域，尤其涉及一种防治枸杞根腐病制剂及制备、使用方法。

背景技术：

枸杞根腐病是一种发生在枸杞上的系统感染病害，枸杞根腐病的发病率能够达到15-20％，是枸杞的一大病害。枸杞根腐病的主要病发部位为枸杞植株根部及茎部基部，发病的枸杞植株根部及茎部基部发生腐烂，茎杆维管束变褐色。潮湿时枸杞患病部位偶尔长出白色或粉红色霉层，该白色或粉红色霉层为病原菌。由于枸杞发生根腐病，使得枸杞叶片变小，缺少光泽，枝条矮化，果实瘦小，叶片变黄萎蔫，严重时枸杞植株会逐渐枯死。当上述在一棵枸杞灌木丛上时，有的表现为部分主枝发病，有的树干病死后可在根颈部又长出新枝条。

枸杞根腐病的发病病原菌为4种镰刀菌，即尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、同色镰刀菌和串珠镰刀菌，其中以尖孢镰刀菌的致病力最强，次为茄病镰刀菌，同色镰刀菌和串珠镰刀菌为弱致病菌。致病力强的病原菌可以从伤口或表皮直接入侵，而致病力弱的病原菌大多数从伤口入侵。

目前对于枸杞根腐病的防治，一般采用的方法有：①新建的枸杞园要选择在地势高燥的沙壤上，严禁栽植有病种苗，从根源上断绝镰刀菌；②常发病地区或田块提倡轮作，尤其是水旱轮作；③整治植地排灌系统，平整土地，高畦深沟栽培，降低地下水位，雨后清沟排渍，防止土壤过湿；④配方施肥，增施磷钾肥，避免施用未充分腐熟的土杂肥；⑤发现病株及时挖除，补栽健株，并在病穴施入石灰消毒，必要时可换入新土；⑥施加农药。上述方法均不能有效治疗枸杞根腐病，且在使用农药防治根腐病时容易残留农药，危害环境，降低枸杞产品的安全质量。

技术实现要素：

本发明提供一种防治枸杞根腐病制剂及制备、使用方法，解决背景技术中使用农药防治枸杞根腐病时，危害环境枸杞产品安全质量低的问题。

本发明提供一种防治枸杞根腐病制剂，所述制剂包括乳酸菌及其代谢产物，所述乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，所述代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸，活菌数≥1×10⁹CFU/ml。

在本发明中，优选地，所述干酪乳杆菌、所述植物乳杆菌、所述苯乳酸、所述苯乙酸-2-丙烯酯和所述乙酸的质量比为(4-10)：(4-10)：(1-5)：(1-5)：(1-3)；更优选的，所述干酪乳杆菌、所述植物乳杆菌、所述苯乳酸、所述苯乙酸-2-丙烯酯和所述乙酸的质量比为4：8：5：3：3。

由于植物乳杆菌有多种，为选取防治枸杞根腐病最好的植物乳杆菌种，需要对植物乳杆菌进行筛选。对植物乳杆菌的筛选通过琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法进行预筛选，预筛选后在通过代谢产物苯乳酸的含量测定进行最后的筛选，具体的筛选过程为：

将347株植物乳杆菌和致病性真菌进行培养，分别形成347种植物乳杆菌菌液和致病性真菌菌液；取200μL浓度为10⁵CFU/ml的致病性真菌菌液放置在20ml PDA(Potato Dextrose Agar，马铃薯葡萄糖琼脂)培养基中，加入100μL植物乳杆菌无细胞悬浮液，形成347种混合菌液。将混合菌液置于4℃的条件下扩散12h，扩散后的混合菌液置于28℃的培养箱中恒温培养48h，培养结束后测量抑菌圈的直径。在上述347种混合菌液中选取53株抑菌圈较大的植物乳杆菌。

将53种植物乳杆菌的发酵上清液分别配制成体积分数为0.1-5.0％的菌液，将培养的菌液放置于20ml PDA培养基中倾注平板，加入培养4天的直径为7mm的真菌菌落，形成混合菌液。将混合菌液置于28℃的培养箱中恒温培养48h，培养结束后测量抑菌圈的直径。在上述混合菌液中选取9种真菌菌落直径较小的植物乳杆菌，从而完成植物乳杆菌的预筛选。

进一步，将所选出的9种植物乳杆菌进行发酵得到其代谢产物，对代谢产物使用LC-MS(Liquid chromatography coupled with mass spectrometry，液相色谱质谱联用)进行苯乳酸含量的测定，其中，LC测试条件为：色谱柱BEH C18；流速0.4ml/min；柱温：45℃；进样量：4μL；流动相A：水+0.1％甲酸；流动相B：乙腈+0.1％甲酸；梯度洗脱3min。MS测试条件为：正离子模式、ESI离子源，锥孔电压20V；碰撞能4V。所测得的数据请参考附图2。

从附图2中能够看出，9种植物乳杆菌所产生的苯乳酸的含量不同，这是由于植物乳杆菌自身菌株的不同而造成的，选取4种苯乳酸含量较高的植物乳杆菌，即编号为IMAU80065、IMAU70101、IMAU70088和IMAU11048，上述4种植物乳杆菌的菌株编号所对应的4种植物乳杆菌为植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99。

在本发明提供的防治枸杞根腐病制剂中，优选地，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为(1-3)：(1-3)：(1-3)：(1-3)；更为优选的，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为1：1：1：1。

一种防治枸杞根腐病制剂的制备方法，所述制备方法包括：

将干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别进行预筛选；

将预筛选后的所述干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌进行筛选；

将筛选后的所述干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌分别单独在MRS培养基(乳酸细菌培养基)中活化20-30h；

将单独活化后的所述干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌混合，混合后活化10-15h；

将混合活化后的所述干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌在25℃条件下自然发酵40-60h，得到含有代谢产物的防治枸杞根腐病制剂。

优选地，所述单独活化时间为24h，混合活化时间为12h。

优选地，所述自然发酵条件为：发酵时间为48h，0.03MPa空气保压，转速为200rpm/min。

一种防治枸杞根腐病制剂的使用方法，所述制剂在4月份施肥时随肥料一起在枸杞根部施用，施用量为3-5kg/亩，所述制剂施用后立即浇水灌溉。

本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

本发明提供一种防治枸杞根腐病制剂，所述制剂包括乳酸菌及其代谢产物，所述乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，所述代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸。同时，本发明还提供了防治枸杞根腐病制剂的制备方法及使用方法。本发明提供防治枸杞根腐病制剂中的干酪乳杆菌和植物乳杆菌能够抑制致病菌、腐败菌的增殖，降解重金属和农药残留，从而改善土壤微生态环境，提高土壤中益生菌的含量；乳杆菌的代谢产物能够促进植物茎叶和根系生长，进而促进作物健康生长；同时，乳酸菌及其代谢产物还能够加速土壤中有机质分解和营养物质释放，促进枸杞对营养元素的吸收。本发明提供一种防治枸杞根腐病制剂能够减少化学药剂的使用，提高枸杞产量及品质，从而达到提升经济效益。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的防治枸杞根腐病制剂制备流程图；

图2为本发明实施例提供的防治枸杞根腐病制剂中苯乳酸的含量检测图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。

请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的防治枸杞根腐病制剂制备流程图，下述具体实施例的制备过程均以附图1为基础。

实施例1

本发明实施例提供了一种防治枸杞根腐病制剂，该制剂包括乳酸菌及其代谢产物，其中，乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸的质量比为4：8：5：3：3，其中，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为1：1：1：1。

实施例2

本发明实施例提供了一种防治枸杞根腐病制剂，该制剂包括乳酸菌及其代谢产物，其中，乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸的质量比为4：10：1：1：1，其中，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为1：3：1：3。

实施例3

本发明实施例提供了一种防治枸杞根腐病制剂，该制剂包括乳酸菌及其代谢产物，其中，乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸的质量比为10：4：5：5：3，其中，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为3：1：1：1。

实施例4

本发明实施例提供了一种防治枸杞根腐病制剂，该制剂包括乳酸菌及其代谢产物，其中，乳酸菌包括干酪乳杆菌和植物乳杆菌，代谢产物包括苯乳酸、苯乙酸-2-丙烯酯和乙酸的质量比为6：6：3：3：2，其中，植物乳杆菌JH68、植物乳杆菌JH76、植物乳杆菌JH85和植物乳杆菌JH99的质量比为2：1：3：1。

本发明实施例还提供了防治枸杞根腐病制剂的制备方法，该制备方法包括：

S01：将干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别进行预筛选；

S02：将预筛选后的所述干酪乳杆菌和所述植物乳杆菌进行筛选；预筛选及筛选的具体过程描述请参考上述内容，此处不再赘述；

S03：将筛选后的干酪乳杆菌和植物乳杆菌分别单独在MRS培养基中活化20-30h；

S04：将单独活化后的干酪乳杆菌和植物乳杆菌混合，形成混合菌液，混合菌液继续活化10-15h；

S05：将混合活化后的干酪乳杆菌和植物乳杆菌在发酵罐中自然发酵得到含有代谢产物的防治枸杞根腐病制剂，其中，自然发酵条件为：发酵温度为25℃，自然发酵时间为40-60h，0.03MPa空气保压，转速为200rpm/min。

本发明实施例提供的防治枸杞根腐病制剂在使用方法为：在4月份施肥时随肥料一起在枸杞根部施用，施用量为3-5kg/亩，制剂施用后立即浇水灌溉。

本发明实施例还提供了施用制剂前后土壤微生物分析的试验，试验中，分别测试施用制剂前后土壤中的真菌、放线菌、芽孢杆菌和细菌总数的数量，检测土壤中有机质、速效磷和碱解氮的含量，根腐病枸杞植株的成活率。试验所测量结果为：真菌数量减少28.57％，镰刀菌数量减少16.32％；放线菌、芽孢杆菌和细菌总数的数量分别增加6.88％、10.70％和46.06％；有机质含量减少27.31％，速效磷含量减少33.67％，碱解氮含量减少27.68％；根腐病枸杞植株的成活率提高32.65％。由上述试验数据结果可知，本发明实施例提供的防治枸杞根腐病制剂能够改善土壤微生态环境，提高土壤中有益微生物的数量，抑制土传病害真菌的数量；同时，制剂还能够促进土壤中有机质分解和氮磷养分释放，进而促进植物对营养元素的吸收。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。