一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]荔枝霜疫霉病是我国荔枝产区普遍发生且危害严重的病害，其病原菌为荔枝霜疫霉售i iperonophythora litchii)0该病于1978年在我国台湾首次报道，目前在广东、广西、福建、海南台湾等地均有发生，不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落花、落果、裂果和烂果，产量损失高达80%以上，甚至绝收，是造成荔枝长期单产低且不稳产的主要原因之一，此外，该病在荔枝果实贮运期仍继续危害，严重影响产量、品质以及鲜果的储运和外销，造成巨大的经济损失，影响荔枝产业可持续稳定发展。
[0003]目前对荔枝霜疫霉病的检测大多仍沿用传统培养和血清学鉴定方法。传统荔枝霜疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长且灵敏度较低，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。
[0004]PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，但由于目前PCR检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)具有简单、快速、高效、经济等特征。该技术可在60°C~65°C恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶DNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1个小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR Green 1、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于荔枝霜疫霉菌的LAMP检测国内外均未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种荔枝霜疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速检测方法。
[0006]实现本发明的目的包括下列步骤:
1.LAMP引物的设计
对荔枝霜疫霉菌序列进行扩增、克隆、测序，获得的荔枝霜疫霉菌7/^7序列，应用在线 LAMP 引物设计软件primer software PrimerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html; Eiken Chemical C0., Japan)设? 套LAMP检测引物，包括1对外引物(F3和B3)和1对内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为:
外侧引物:
F3:5’ -CCGTACGATCGAGCTGGA-3’ ；
B3:5’ -CCGTCACGTCGTACACCA-3’ ；
内侧引物:
FIP:5’ -TCGACTCAAGGTTACAGAACGCTGCAAGACCATCAAGCTCCA-3’ ；
BIP:5’ -GTGCTTTTATAGTGGGACACCGCCGCGGTAGTAGCTGCTAGT-3’ ；
2.荔枝霜疫霉菌快速检测体系的建立
所述的LAMP反应体系为25.0 4 1^包括？3与83各0.2卜]\1，FIP与BIP各1.6μΜ，1 X Thermopol Buffer, 1.0 mM dNTPs, 0.8 M 甜菜喊，6.0 mM 硫酸儀，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶为，50 ng模板DNA，50 μΜ钙黄绿素，500 μΜ氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足。
[0007]所述的LAMP反应条件为在63°C温育60 min，80°C保温5min。
[0008]所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法:在LAMP反应体系中以50 μ Μ钙黄绿素-500 μ Μ氯化锰为显色剂，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橘黄色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法:取2uL LAMP产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
[0009]该方法可用于带菌植株的高灵敏度快速检测。建立荔枝霜疫霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的监测技术体系，对于荔枝霜疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
本发明的关键性技术是荔枝霜疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证荔枝霜疫霉菌的特异引物序列，本发明以我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌和其它13种不同卵菌及9种真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取0.lg冷冻干燥后的菌丝粉于5.0mL离心管中，加入2mL65°C预热的2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(提取液的配方为:2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl (三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，pH 8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和0.2%巯基乙醇)充分混匀后，于65°C水浴lh，每10 min振荡混匀一次。水浴结束后取出，放至室温。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)，充分颠倒混合，将提取液中含有的蛋白杂质变性，分装至2.0mL离心管中，室温下12，OOOrpm离心lOmin。将上清液(水相)转移到新1.5mL离心管中，向上清中加入1倍体积异丙醇，充分颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀(可室温或-20°C放置l-2h促进DNA沉淀)，4°C离心，12，OOOrpm, 20min。弃上清，加入500μ?70%乙醇洗涤，颠倒混匀，至沉淀悬起，4°C，12，OOOrpm离心5min。重复洗涤一次，弃酒精，在超净工作台上自然晾干无酒精味后加入适量无菌双蒸水溶解DNA，DNA溶解后，按样品体积加入1/10体积的 RNaseA (10mg/mL)并在 37°C处理 lOmin，去除 RNA，得到 DNA 溶液，用 NanoDrop 检测 DNA浓度并稀释备用。
[0010]经对供试菌株和21株荔枝霜疫霉菌的特异性进行LAMP验证。
[0011]LAMP反应体系为 25 uL:包括F3 与 B3 各0.2μΜ，FIP与 BIP各 1.6μΜ，1 XThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜碱，6.0 mM 硫酸镁，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶为，50 ng模板DNA，50 μΜ钙黄绿素，500 μΜ氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足。
[0012]所述的LAMP反应条件为在63°C温育60 min，80°C保温5min。
[0013]除了来自我国福建、广东、广西、台湾等省的21株荔枝霜疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带，检测了其它13种不同卵菌及9种真菌显色结果为橘黄色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。这说明该引物可被用于生产实践中发病组织及土壤中荔枝霜疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
[0014]当在用于荔枝组织中存在荔枝霜疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取荔枝霜疫霉菌的DNA，具体过程如下:(1)将荔枝病叶或病茎洗净、晾干，剪取发病部位；(2)按lmg病叶加入10uL (0.5mol/L NaOH,0.5%PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12，000g离心机中离心5min ； (3)取上清20uL与等体积的0.1 mol/L的Tris-HCl (pH8.0)混合；(4)稀释10倍、100倍、1000倍，分别取1 μ?原液、10倍、100倍、1000倍液作为LAMP模板进行等温扩增。
[0015]按如下LAMP反应体系和反应条件用所设计的引物进行检测:
① LAMP 反应体系为 25 uL:包括 F3 与 B3 各 0.2μΜ，FIP 与 BIP 各 1.6μΜ，1 X ThermopolBuffer, 1.0 mM dNTPs,0.8 M 甜菜碱，6.0 mM 硫酸镁，0.1% Tween-20,
8 U DNA聚合酶为，1 μ?模板DNA，50 μ Μ钙黄绿素，500 μ Μ氯化锰，不足部分用无菌双蒸水补足。
[0016]所述的LAMP反应条件为在63°C温育60 min，80°C保温5min。
[0017]②LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光，或取2uL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断所述的荔枝组织中存在荔枝霜疫霉菌；否则所述的荔枝组织中不存在荔枝霜疫霉菌。
[0018]本发明有益效果:本发明方法适用于发病组织中荔