家蝇胚胎细胞构建抗菌肽attacin真核表达系统所表达的产物及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物基因工程技术，为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系， 尤其涉及家绳胚胎细胞构建抗菌肽attacin真核表达系统所表达的产物及构建方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 家蝇作为最常见的昆虫，长期生活在肮脏的环境而自身不被感染，是研究昆虫抗 菌肽最好的材料之一。目前从家蝇体内分离的天然抗菌肽attacin具有广谱抗菌作用，具 有较强的抗菌活性。由于昆虫抗菌肽提取、纯化困难，化学合成昂贵，且不易标准化，无法规 模生产是制约其进入实际应用的最大障碍。因此，通过基因工程技术规模生产为理想手段。 基因工程生产抗菌肽，稳定、高效的表达系统是关键。由于抗菌肽本身具有抗菌活性，对宿 主菌有杀伤作用，因而目前抗菌肽在原核中表达多采用融合表达方式。原核系统操作简便， 但表达的蛋白往往不能有效正确的翻译，使得选择真核表达系统成为目前抗菌肽基因工程 研究的热点。
[0004] 昆虫杆状病毒表达载体系统（Baculovirusexpressionvectorsystem,BEVS)具 有安全性尚、基因克隆容量大、具有完备的翻译后加工修饰系统、尚效表达外源基因、无内 毒素污染等优点，利用昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白，其功能和结构与天然蛋白 相似，是实现大规模低成本生产基因工程产品的有效手段。目前用于BEVS的细胞系主要有 3个，商品化的BEVS主要使用草地贪夜蛾卵巢组织的Sf21细胞系和其衍生株Sf9。与病毒 表达载体的研发和细胞生长培养基的商品化相比，杆状病毒表达载体系统中昆虫细胞系的 建立和改进稍显落后。近年来从鳞翅目昆虫建立的一些新的细胞系，但尚未发现在蛋白表 达方面表现优秀的细胞系。
[0005] 本发明以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，制备重组杆状病毒 Bacmid-pFastBac?-attacin转染自行建立的家绳胚胎细胞系，构建抗菌肽attacin的家 蝇胚胎细胞真核表达系统。本发明为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用 于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明以家绳抗菌肽attacin为目标基因，全基因合成家绳抗菌肽attacin，制备 重组杆状病毒Bacmid DNA (Bacmid-pFastBac?-attacin)转染自行建立的家绳胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，提取家蝇胚胎细胞培养 上清和细胞裂解物粗蛋白，经镍柱纯化，SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白表达情况进行检 测、鉴定，并对表达产物进行抗菌活性检测。本发明成功构建抗菌肽attacin的家绳胚胎细 胞真核表达系统，表达产物具有生物学活性，为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇 胚胎细胞用于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为自建昆虫细胞系作为杆状病毒表达载 体系统候选昆虫细胞等进一步推广应用提供方向。
[0008] 制备步骤及方法： 1. 1细胞和质粒 家蝇胚胎细胞系（MDEC-07114)、重组杆状病毒Bacmid-pFastBacTM-attacin由本寄生 虫教研室自行建立和保存； 1. 2主要实验试剂 金普诺安昆虫细胞培养基（GPM-115)(金普诺安蛋白质工程技术有限公司）；Cellfectin转染试剂(美国Invitrogen公司）；一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒(上 海生工)、Ni-NTASefinoseTMResinKit(上海生工)、UNIQ-200柱式质粒中量抽提试剂盒 (上海生工）；胎牛血清（FBS)(杭州四季青生物工程研究所制品）；蛋白Marker(购自大连 TaKaRa公司）；BCA蛋白定量试剂盒、考马斯亮蓝R-250、羊抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP 标记二抗(碧云天生物技术研究所）;Anti-His(Abcam);GAPDH(Fermentas) ;NC膜、发光液 (美国millipore公司）；吐温-20 (美国Amresco公司）;显影粉、定影粉(上海冠龙公司）； 大肠埃希菌44113由课题组自行保存。
[0009] 1. 3方法 1. 3. 1attacin基因合成 根据Genbank登录号AY460106的序列号委托上海生工生物工程有限公司合成，基因全 长627bp。
[0010] 1. 3. 2家蝇抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体的构建及鉴定 1. 3. 2. 1attacin基因的合成 委托上海生工生物工程有限公司合成，基因全长627bp，并在5'和3'端分别加入EcoRI和PstI两个酶切位点。
[0011] 抗菌肽attacin的基因序列（GenBank登录号AY460106): 1. 3. 2. 2 attacin克隆入质粒PUC57 ⑴目的基因和质粒PUC57的双酶切及回收：用EcoRI、PstI对目的基因和PUC57质 粒进行双酶切，其中质粒含AMP抗性。
[0012] PUC57质粒双酶切体系： PUC57 2μL EcoRI 1μL PstI 1μL lOXFastDigest Buffer 2μL ddH20 14μL Total 20μL 37°C水浴酶切5min后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果。紫外灯下切下目的产物 使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。
[0013] (2)目的基因和质粒PUC57的反应连接： 将双酶切后目的基因和质粒HJC57的纯化产物按照摩尔比6:1混合，建立20μL的连 接反应体系。将各体系中溶液混匀，低温连接仪中16 °C反应18h。
[0014] (3)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒并送上海生工测序： ① 转化： ② 摇菌：用枪头挑取阳性单菌落加至含4mLLB培养基的离心管，封口，37°C，150rpm振 摇 12h。
[0015] ③提取质粒及鉴定： 1.3.2.3 attacin亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 (l)pFastBac?HTA质粒双酶切及回收：用EcoR I、Pst I对pFastBac?HTA质粒经行双 酶切。
[0016] pFastBac?HTA双酶切体系： pFastBac?HTA 2μL EcoR I 1μL Pst I 1μL lOXFastDigest Buffer 2μL ddH20 14μL Total 20μL 37°C酶切5min.最后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果。紫外灯下切下目的产物 使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化以备连接用。
[0017] ⑵次级片段亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 参考Luckow方法，将pFastBac?HTA线性载体与attacin目的片段进行连接，连接体系 如下： 1. 3. 2. 4重组Bacmid的制备(1)转化到DHlOBac Ecoli 将DHlOBac感受态细胞在冰上解冻，在超净台内将100μLDHlOBac感受态细胞转入1.5mLEppendorf管里，向其中加入上述连接产物20μL，轻轻混匀，冰上孵育30min;42°C 热休克45s(休克过程中勿晃动溶液)，然后立即置于冰上2min。加入室温的无抗生素的LB 液体培养基900μL，37°C，225rpm振摇4h。5,OOOrpm离心3min，弃去800μL上清后，轻柔 吹起沉淀，混匀；将已转化的感受态细胞吸取10 μL涂布于IPTG-X-gal筛选平板上，倒置平 板，37°C培养48h。
[0018] ⑵重组BacmidDNA的分离； (3)重组质粒的鉴定； 根据重组Bacmid DNA两端的M13引物序列位于LacZa互补区域内的mini_attTn7位 点的两侧，可对插入基因进行PCR鉴定。
[0019] PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分离的重组Bacmid DNA送大连宝生物测序鉴 定。
[0020] 1.3. 3 Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 取冻存的家蝇胚胎细胞MDEC-07114,于37°C快速复苏后接种于一次性培养瓶中，用含 10%FBS、1%双抗的GPM-115培养基，5%C02, 28°C，孵箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长 期细胞进行实验。
[0021] 本研究发明采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统方法将课题组自制备的重组杆状 病毒Bacmid-pFastBac?-attacin转染家绳胚胎细胞，分别于实验开始、感染12h、48h、72h 观察细胞的形态变化，以常规方法培养细胞为实验对照组。
[0022] 1. 3. 4重组病毒的扩增 扩增低滴度P1毒株，从而产生高滴度的毒株P2 (滴度为1X107pfu/mL到1X10spfu/mL)，在25mL培养瓶里接种入6X106个MDEC-07114细胞，活力>97%，新鲜GPM-115培养液 加至6mL，扩增病毒时加转染后的病毒上清60μL(M0I=0. 1)，28°C培育48h后，500Xg离心 5min，收集上清（P2)。
[0023] 1· 3· 5抗菌肽attacin的表达 将杆状病毒株P2转染家蝇胚胎细胞，转染时细胞要求同前，每6X106个MDEC-07114 细胞加病毒上清P2 3mL(M0I=5)，28°C培育72h后，500Xg离心5min，收集上清（上清总蛋 白），保存于-80°C备用。
[0024] 1. 3. 6表达产物attacin的提取、纯化 将细胞转移到Eppendorf管内，3,OOOrpm，离心5min，弃上清，预冷的一倍PBS洗涤，加 入lmL抽提试剂(含1μLDTT、10μLPMSF、1μL蛋白酶抑制剂);4°C，温育10min，漩涡中速震 荡；冰浴10min，期间漩涡剧烈震荡3-4次，每次30秒；12, 000g，4°C，离心5min，取上清(细 胞裂解物总蛋白）。用BCA法及