SDS-PAGE分析分别测定、分析上清总蛋白、细胞裂解物总蛋 白及其各自采用亲和层析法（Ni-NTA亲和层析柱）纯化后的蛋白。
[0025] 1. 3. 7目的蛋白的表达与鉴定 实验分6组(空白对照组、50yL P2感染组、100yL P2感染组、200 yL P2感染组、250 μ L P2感染组、500 μ L P2感染组），将生长于对数期的家蝇细胞接种于6孔培养板，每 孔2Χ 106个MDEC-07114细胞，按上述方法对各组细胞培养72h后，对培养上清进行蛋白提 取，纯化方法同前。取其中一部分目的蛋白进行Western blot检测，观察结果。另一部分 胶与NC膜紧贴进行转移电泳，后再进行转膜和ECL显影，扫描显影条带，用ImageJ分析软 件检测每个特异条带灰度值。
[0026] L 3. 8表达产物抗菌活性检测 采用大肠杆菌、纸片扩散法检测目的蛋白的抗菌活性。
[0027] 2结果 2. 1成功构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体 成功构建含家绳抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体（Bacmid-pFastBac?-attac in)，并经测序证实； 2. 2Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 用Bacmid对家绳细胞进行转染，分别于实验开始、感染后12h、48h、72h观察细胞的形 态变化，结果显示：对照组细胞形态无明显变化，细胞透亮，呈圆形、梭形及多边形，细胞生 长速度也无明显变化（图l、2);12h病毒组细胞体积增大；48h病毒组大部分细胞停止生长， 细胞不再增大，核显示不清，出现小泡，细胞核增大，部分充满细胞；72h病毒组细胞停止生 长，出现颗粒，部分从培养瓶脱离（图3-5)。
[0028] 2. 3目的蛋白的表达、鉴定 杆状病毒感染家蝇胚胎细胞MDEC-07114的培养上清和细胞裂解物及通过镍柱纯化的 培养上清和细胞裂解物，经SDS-PAGE检测，在22KD附近出现了一条特异性条带，这与目的 蛋白的理论分子量21. 78KD基本一致（图6)。经BCA法测定，得到上清总蛋白含量浓度为 5. 5mg/mL，细胞裂解物总蛋白含量浓度为3.Omg/mL，上清纯化产物蛋白含量为0. 53mg/mL， 细胞裂解物纯化蛋白浓度为〇. 12mg/mL。 Μ:蛋白marker;1:细胞裂解物总蛋白；2 :细胞裂解纯化物；3:上清总蛋白；4 :上清纯 化物 Westernblot检测转染72h后各组细胞上清纯化蛋白，各实验组灰度值明显高于对照 组，说明各细胞组上清均有抗菌肽attacin的表达（表1，图7-8)。
[0029] 表1不同数量病毒组的灰度值的变化 Tapi.Thechangesofgrayvaluefordifferentamountofvirusgroups
2. 4表达产物抗菌活性检测 家绳胚胎细胞表达抗菌肽attacin对大肠杆菌具有抗菌活性。
[0030] 3结论与分析 目前生物药物的市场需求远超于生产能力，工程细胞的优化、筛选对生物制药具有重 要影响。抗菌肽作为一类新的抗菌资源，来源有限，无法规模生产，通过基因工程技术生产 为理想手段。昆虫细胞-杆状病毒表达系统可以高效表达异源蛋白，是生产蛋白的重要工 具，但该表达系统中昆虫细胞系的研发稍显落后。因此，构建抗菌肽的昆虫细胞-杆状病毒 表达系统并使其高效表达意义重大。本发明以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，全基因合 成家绳抗菌肽attacin，制备重组杆状病毒Bacmid DNA (Bacmid-pFastBac?-attacin)转 染自行建立的家蝇胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达 系统，表达产物具有生物学活性，为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用 于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系。
[0031] 本发明取得的有益效果：课题组自行建立家蝇胚胎的细胞系MDEC-07114是一个 能够稳定传代的昆虫细胞系。该细胞系的建立不仅丰富了昆虫细胞库，对昆虫细胞培养技 术的完善、培养昆虫细胞在分子生物学、遗传学等方面的应用都有重要意义。本发明成功 将含家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体转染自建家蝇胚胎细胞，经SDS-PAGE 和Western-Blot检测证实抗菌肽attacin的表达，且表达产物具有生物学活性。由于家 蝇胚胎细胞MDEC-07114为本发明申请人独家拥有，实验证实该细胞可作为抗菌肽的真核 表达工具。经证实，抗菌肽attacin利用杆状病毒穿梭载体在该细胞中的表达这一技术发 明是首例，抗菌肽attacin通过构建的重组杆状病毒（Bacmid-pFastBacTM-attacin)在自 建家蝇胚胎细胞中得到表达。由此可见，自建家蝇胚胎细胞系MDEC-07114可作为抗菌肽 attacin的真核表达工具用于杆状病毒表达系统，该表达系统的建立不仅为抗菌肽的生产 和进一步通过获得的纯化抗菌肽用于抗菌、抗肿瘤等机理研究打下基础，也为自建昆虫细 胞系作为杆状病毒表达载体系统候选昆虫细胞等进一步推广应用提供方向。
【附图说明】
[0032] 图1为对照组（100X)。
[0033] 图2为对照组（400X)(箭头所指为细胞核)。
[0034]图 3 为 12h病毒组（100X)。
[0035] 图4为48h病毒组（400X)(箭头所指细胞出现小泡)。
[0036] 图5为72h病毒组（400X)(箭头所指细胞呈颗粒状)。
[0037]图 6 为SDS-PAGE分析attacin。
[0038] 图中：Μ:蛋白marker;1:细胞裂解物总蛋白；2:细胞裂解纯化物；3:上清总蛋 白；4 :上清纯化物。
[0039] 图7为不同数量病毒组的attacin蛋白表达。
[0040]图8为不同数量病毒组灰度值柱形图。
【具体实施方式】
[0041] 本发明所述的【具体实施方式】，在
【发明内容】
的基础上再作详细说明，以家蝇抗菌 肽attacin为目标基因，全基因合成家绳抗菌肽attacin，制备重组杆状病毒BacmidDNA (Bacmid-pFastBac?-attacin)转染自行建立的家绳胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽 attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，提取家蝇胚胎细胞培养上清和细胞裂解物粗蛋白， 经镍柱纯化，SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白表达情况进行检测、鉴定，并对表达产物进 行抗菌活性检测。本发明成功构建抗菌肽attacin的家绳胚胎细胞真核表达系统，表达产 物具有生物学活性，为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用于抗菌肽的基 因工程生产奠定基础，也为自建昆虫细胞系作为杆状病毒表达载体系统候选昆虫细胞等进 一步推广应用提供方向。
[0042] 制备步骤及方法： 1. 1)细胞和质粒 家蝇胚胎细胞系（]\0^(：-07114)、重组杆状病毒83〇^(11?38丨83(^]\1-3?3(^11由本寄生虫教研室自行建立和保存； 1.2)主要实验试剂 金普诺安昆虫细胞培养基（GPM-115)(金普诺安蛋白质工程技术有限公司）；Cellfectin转染试剂(美国Invitrogen公司）；一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒(上 海生工)、Ni-NTASefinoseTMResinKit(上海生工)、UNIQ-200柱式质粒中量抽提试剂盒 (上海生工）；胎牛血清（FBS)(杭州四季青生物工程研究所制品）；蛋白Marker(购自大连 TaKaRa公司）；BCA蛋白定量试剂盒、考马斯亮蓝R-250、羊抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP 标记二抗(碧云天生物技术研究所）;Anti-His(Abcam);GAPDH(Fermentas) ;NC膜、发光液 (美国millipore公司）；吐温-20 (美国Amresco公司）;显影粉、定影粉(上海冠龙公司）； 大肠埃希菌44113由课题组自行保存。
[0043] 1. 3 )方法 1. 3. 1)attacin基因合成 根据Genbank登录号AY460106的序列号委托上海生工生物工程有限公司合成，基因全 长627bp。
[0044] 1. 3. 2 )家蝇抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体的构建及鉴定 1.3. 2.1)attacin基因的合成 委托上海生工生物工程有限公司合成，基因全长627bp，并在5'和3'端分别加入EcoRI和PstI两个酶切位点。
[0045] 抗菌肽attacin的基因序列（GenBank登录号AY460106): 1. 3. 2. 2 )attacin克隆入质粒PUC57 ⑴目的基因和质粒PUC57的双酶切及回收：用EcoRI、PstI对目的基因和PUC57质 粒进行双酶切，其中质粒含AMP抗性。
[0046]PUC57质粒双酶切体系： PUC57 2μL EcoRI 1μL PstI 1μL lOXFastDigestBuffer 2μL ddH20 14μL Total 20μL 37°C水浴酶切5min后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果。紫外灯下切下目的产物 使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。
[0047] (2)目的基因和质粒PUC57的反应连接： 将双酶切后目的基因和质粒HJC57的纯化产物按照摩尔比6:1混合，建立20μL的连 接反应体系。将各体系中溶液混匀，低温连接仪中16 °C反应18h。
[0048] (3)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒并送上海生工测序： ① 转化： ② 摇菌：用枪头挑取阳性单菌落加至含4mLLB培养基的离心管，封口，37°C，150rpm振 摇 12h。
[0049] ③提取质粒及鉴定： 1. 3. 2. 3 )attacin亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 (l)pFastBac?HTA质粒双酶切及回收：用EcoRI、PstI对pFastBac?HTA