复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种复制型重组人55型腺病毒载体及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，其基因组约35_40kb，已知人腺病毒共7个 亚群（A-G)，60多个血清型，其中3、4、7、14型感染可导致急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。 近年来，出现了由人11型与14型腺病毒重组产生的55型腺病毒（以下简称Ad55)，因人群 普遍缺乏针对这种病毒的免疫力，很容易引起呼吸道传染病疫情，尤其是入伍新兵、寄宿制 学校、托幼机构等在封闭环境中生活的群体。目前，尚无针对腺病毒感染的特效治疗药物， 亦无可在普通人群中使用的腺病毒疫苗。因此，构建基于Ad55病毒的复制型报告病毒，对 于研发抗人55型腺病毒的疫苗、药物及中和抗体至关重要。
[0003]同时，由于Ad55尚未大规模流行，人群中针对Ad55的中和抗体阳性率较低。因 此，基于Ad55的基因载体可潜在的携带抗原基因或治疗性基因在普通人群中使用。腺病毒 载体具有一系列优势，包括：1.安全性，腺病毒遗传背景相对清楚，基因组不整合至宿主染 色体因而不会导致插入突变，删除其E1或E3基因可进一步降低腺病毒的致病力；2.有效 性，腺病毒可高效感染分裂期及静息期细胞，携带的外源基因可长期高水平表达，具备较大 的容纳外源基因的能力；3.生产工艺成熟，腺病毒可在宿主细胞中复制增长到很高的滴度 因而容易大规模生产，理化性状稳定因而可方便地运输、储存等。因此，腺病毒载体已广泛 用作基因表达载体、重组疫苗载体和基因治疗载体等，全球范围内已有数百项临床试验以 腺病毒作为基因载体，居各类载体之首（24.8%)。我国具自主知识产权的基因治疗药物今 又生（重组人P53腺病毒注射液），即使用复制缺陷型的人5型腺病毒载体。
[0004]然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生一定水平的抗腺病毒免疫反应，包 括抗腺病毒中和抗体和杀伤性T细胞（CTL)。研究表明非洲和南美等发展中国家和地区的 人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超过90%。我们的研究也表明广东地区人群中 Ad5中和抗体阳性率高达75%。这些中和抗体会抑制腺病毒载体产品进入机体细胞，使其 难以行使免疫或治疗功能。此外，针对腺病毒载体的CTL反应亦可杀死靶细胞而抑制治疗 性基因的持续表达。
[0005]为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术：
[0006] 1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应。但是 免疫抑制剂不具有特异性，往往带来显著的毒副作用，尤其是在免疫缺陷的人群。
[0007]2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体。腺病毒表面蛋白经修饰 或改造之后，掩盖其中和表位，从而可有效的进入靶细胞发挥生物学功能。但是，包裹的腺 病毒粒子在细胞内释放效率被削弱，而改造表面蛋白的腺病毒载体使用一次即可产生新的 抗载体免疫反应，不能重复使用。
[0008] 3)以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术。PBMC分离并清洗之后，可 经离心感染技术高效感染腺病毒载体。该技术可有效应用于经血液途径免疫或输送治疗性 基因，但其应用范围有限。
[0009] 4)采用在人群中流行率较低的稀有血清型腺病毒作为载体。人群中针对稀有血清 型腺病毒的预存免疫反应往往较低，因而这些载体在临床中具有极大的应用潜力。
[0010] 因此，基于人55型的腺病毒载体，一方面可为抗腺病毒疫苗、药物或中和抗体研 究提供技术平台，另一方面也可作为肿瘤、遗传性疾病的基因治疗载体及抗其他传染性疾 病如HIV、流感等的疫苗载体。
[0011] 此外，腺病毒基因组长达35-40Kb，较少出现单酶切位点，在目标区域敲除特定基 因或整合外源序列有一定操作难度。目前常用的技术是在目标区域找到合适酶切位点（往 往并非单一酶切位点）并进行部分酶切，使部分基因组在该位点断裂，与含重组臂并带有 目的序列的质粒同源重组。该技术的缺陷在于，部分酶切往往导致多数基因组质粒未被有 效切开，重组克隆难以通过抗性筛选高效获得。因此，本发明开发了一种基于基因组部分 酶切以及双抗性筛选的重组技术，使得在目标区域整合入特定外源序列的操作更加简便易 行。
【发明内容】
[0012] 本发明的主要目的在于提供一种复制型人Ad55重组腺病毒载体及其制备方法。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下。
[0014] 一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
[0015] (1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端反向重复 序列（ITR)作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因 组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A(即pAd55);
[0016] (2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那 抗性载体，线性化后与线性化的步骤（1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛 选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55AE3-Kana);
[0017] (3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的步骤⑵所述基因组质粒B同源 重组，得到去除Kana基因的pAd55ΛE3质粒，并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动 物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
[0018] 或者，一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
[0019] (1)以人55型腺病毒基因组为模板，分别扩增人55型腺病毒基因组两端ITR区序 列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠 杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒Α(即pAd55);
[0020] (2)以Ad55基因组为模板，扩增人55型腺病毒E3区两端序列并反向连接至卡那 抗性载体，线性化后与如步骤（1)所述环化的基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛 选，得到去除E3基因的基因组质粒B(即pAd55AE3-Kana);
[0021] (3)构建敲除Kana基因的穿梭质粒，与线性化的基因组质粒B同源重组，得到去除 Kana基因的pAd55ΔE3质粒；
[0022] (4)将Ad55基因的E3区两端序列连接至卡那抗性载体，并将外源序列插入至E3 区两端序列之间，构建携带外源基因表达框的穿梭质粒，再与线性化后的基因组质粒C同 源重组，在原E3区整合唯一酶切位点，得到E3区缺失并整合外源序列的基因组质粒，线性 化后再转染哺乳动物细胞，离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。
[0023] 在其中一个实施例中，所述步骤（1)为：
[0024] 以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂L-arm及 R-arm；
[0025]L-arm连接至pUC载体得到pUC-L;R_arm以EcoRI+Xbal双酶切后连接至 EcoRI+Xbal双酶切的pUC-L得到环化穿梭质粒pUC_(L+R);
[0026]pUC-(L+R)以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化感受态细胞，得到 pAd55质粒。
[0027] 在其中一个实施例中，所述步骤（2)为：
[0028] 以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L_delE3及 R-delE3；
[0029]L_delE3以Spel+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L_delE3; R-delE3以EcoRI+Xbal双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭 质粒pVax_delE3(L+R);
[0030]pVax_delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI经部分酶切线性化，共转化感 受态细胞，涂至氨苄、卡那双抗性平板，提取阳性克隆继续转化感受态细胞，得到去除E3基 因并在E3区引入唯一酶切位点Swal的基因组质粒pAd55AE3-Kana。
[0031] 在其中一个实施例中，所述步骤（3)为：
[0032] 以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK及 R-delK；
[0033]L-delK以Spel+EcoRI双酶切后连接至Spel+EcoRI酶切的pVax载体得到 pVax-L-delK;R-delK以EcoRV+Xbal双酶切后连接至EcoRV+Xbal双酶切的pVax-L-delK 得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax_delK(L+R) ;pVax_delK(L+R)质粒以Spel+Xbal酶 切，回收delK(L+R)片段；pAd55AE3-Kana以Swal线性化；delK(L+R)片段和线性化的 pAd55ΛE3-Kana共转染感受态细胞，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΛE3质粒。
[0034] 在其中一个实施例中，所述步骤（4)为：
[0035] 以pVAX质粒为模板，PCR得到VAX骨架；
[0036] 以Ad55基因组为模板，PCR得到E3区上下游同源重组臂SE3L及SE3R;
[0037]Vax骨架以Spel切，SE3L以Xbal切后加磷酸化，连接得到p-SE3L;pSE3L以 Spel+EcoRV切，SE3R以Spel切，连接得到pSE3LR;
[0038] 将外源基因表达框连接得到pSE3LR，得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒；
[0039] 携带外源基因表达框的目标穿梭质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收； pAd55AE3以Swal线性化后乙醇沉淀回收；共转化感受态细胞，同源重组得到携带外源基 因表达框的pAd55ΛE3-外