拟穴青蟹抗菌肽scy2的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及拟穴青蟹，尤其是涉及拟穴青蟹抗菌肽SCY2的表达载体构建和毕赤 酵母表达产物的制备方法。
【背景技术】
[0002] 拟穴青蟹是我国东南沿海的重要海产养殖品种，其具有个体大、肉质好、营养丰富 等特点，深受人们喜爱。近年来，随着养殖规模不断扩大、环境污染加重、致病菌大量增生等 问题的出现，拟穴青蟹发生了大规模的死亡，使我国海产养殖业遭到了巨大的经济损失。
[0003] 抗菌肽是甲壳类动物先天性免疫中的重要免疫活性因子，已报道的甲壳动物抗菌 肽主要包括：penaeidin[1'2]，Crustin[3 5]，抗脂多糖因子（ALF)[6 8]，以及青蟹性腺特异高表 达的抗菌肽Scygonadin?。抗菌肽在海水养殖鱼类、甲壳类等的疾病防治中作为抗耐药性 细菌的药物和饲料添加剂具有广阔的应用前景。研究、开发和应用抗菌肽，对解决在海水养 殖中由于抗生素的滥用导致的耐药性细菌的产生和水产品药物残留超标等问题具有重要 的科学意义和应用价值。
[0004] 本申请人在拟穴青蟹中克隆获得了 一个新抗菌肽SCY2,运用ProtParam工具分析 结果显示，SCY2成熟肽含有100个氨基酸残基，平均分子量为10925. 4Da，PI为4. 84,为阴 离子抗菌肽。同时本申请人研究发现，拟穴青蟹抗菌肽SCY2可能在青蟹的生殖免疫中起着 重要作用[1°]。
[0005] 参考文献：
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【发明内容】
[0016] 本发明的第一目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法。
[0017] 本发明的第二目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SCY2在制备细菌生长抑制剂中的应 用。
[0018] 所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，包括以下步骤：
[0019] 1)拟穴青蟹抗菌肽SCY2表达载体的构建：设计上游引物，设计时在Y端EcoRI 酶切位点前加入Kex2酶切位点氨基酸序列所对应的碱基序列，PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽 SCY2基因，将所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因插入pPIC9K载体中，即得pPIC9K-SCY2重组表 达载体；
[0020] 2)将步骤1)所得到的重组表达载体转化入宿主细胞，对宿主细胞进行诱导表达， 获得表达产物；
[0021] 3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，再进行N端测序，确定所获得的表达产物为 具有与天然蛋白有相同N端的拟穴青蟹抗菌肽SCY2。
[0022] 在步骤1)中，所述引物序列如下：
[0023] gggGAATTCGAGAAAAGAGGCCTGGCACTCAACAGACTTATG；
[0024] 所述PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因的Genbank登录号为EF555444。
[0025] 所述表达载体用于表达序列为SEQIDNo. 1的拟穴青蟹抗菌肽SCY2序列。
[0026] 所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸片段序列为SEQIDNo. 2。
[0027] 在步骤3)中，所述分离纯化的方法为将步骤2)所得的表达产物进行离心，收集发 酵上清液，对发酵上清液进行透析后，亲和层析后即获得纯化的拟穴青蟹抗菌肽SCY2。
[0028] 抗菌实验结果显示，拟穴青蟹抗菌肽SCY2对革兰氏阳性菌，如溶壁微球菌具有较 强的抗菌活性（MIC= 12. 5~25μM)，对藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌具有一定的抗菌活性 (MIC= 25~50μΜ)，对革兰氏阴性菌无抗菌活性（MIO50μΜ)。可见真核表达的SCY2具 有一定的抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。
[0029] 所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2可在制备细菌生长抑制剂中应用。所述拟穴青蟹抗菌 肽SCY2还可在制备动物饲料添加剂以及抗病原微生物药物中应用。
[0030] 所述细菌主要为革兰氏阳性菌，如藤黄微球菌（Micrococcusluteus)、谷氨酸棒 杆菌（Corynebacteriumglutamicum)和溶壁微球菌（Micrococcuslysodeikticus)。
[0031] 所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的基因序列为：
[0033] 所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸序列为：
[0034]
[0035] 本发明旨在获得与天然蛋白具有相同N末端的拟穴青蟹抗菌肽SCY2的真核表达 产品，并对其抗菌活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物。本发明根据拟穴青蟹抗 菌肽SCY2基因序列特征，通过基因工程表达技术，成功获得具有生物活性的拟穴青蟹抗菌 肽SCY2,其具有与天然蛋白相同的N端，验证拟穴青蟹抗菌肽SCY2具有一定抗菌活性，为其 作为抗病原微生物新药的开发奠定基础。
【附图说明】
[0036] 图 1 为SCY2 PCR电泳图谱。Μ为DNAMarkerDL2000,1 为SCY2 PCR片段。
[0037] 图2为pPIC9K表达载体酶切前后电泳图。1为pPIC9K载体酶切前片段，Μ为DNA MarkerDL2000, 2为pPIC9K载体酶切后片段。
[0038] 图3为pPIC9K-SCY2真核表达载体构件图。
[0039] 图4为SDS-PAGE分析SCY2的表达和纯化情况。M:预染蛋白Maker(BioBasic公 司）；1:毕赤酵母表达的SCY2蛋白；2:流出组分；3,4:纯化的抗菌肽SCY2。
[0040] 图5为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D01led测序结果。
[0041] 图6为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D02led测序结果。
[0042] 图7为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D03led测序结果。
[0043] 图8为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D04led测序结果。
[0044] 图9为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D05led测序结果。
[0045] 图10为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D06led测序结果。
[0046] 图11为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D07led测序结果。
[0047] 图12为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D08led测序结果。
[0048] 图13为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D09led测序结果。
[0049] 图14为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列DIOled测序结果。
[0050] 图15为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列Dllled测序结果。
[0051] 图16为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列Dllled测序结果。
【具体实施方式】
[0052] 以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。
[0053] 实施例1重组表达载体pPIC9K-SCY2的构建
[0054] 1)扩增拟穴青蟹SCY2成熟肽序列
[0055] 根据pPIC9K载体多克隆位点和拟穴青蟹SCY2基因序列（Genbank登录号： JX228177)，设计扩增SCY2基因的上、下游引物。上游引物Y端加入Kex2酶切位点和 EcoRI，下游引物:V端加上NotI酶切位点，终止密码子和6XHis组氨酸标签。SCY2基 因的引物设计如下：
[0056]上游引物F:gggGMTTCGAGAAAAGAGGCCTGGCACTCAACAGACTTATG
[0057]EcoRIKex2 识别位点
[0058]下游引物R:catGCGGCCGCΤ?ΑATGGTGATGGTGATGATGGTAGGAAGCAAGCCAGTCC
[0059]NotI终止密码子 6XHis