专利名称：一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法
技术领域：
本发明属于拟穴青蟹遗传标记检测领域，特别是涉及一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)分子标记几乎存在于所有真核生物基因组中，是生物基因组中最丰富的遗传变异资源。SNPs具有典型的二等位基因性，大多数生物基因组平均每200bp IOOObp核苷酸中就会存在一个SNP。由于SNPs具有众多优点，因此被认为是遗传学和进化学研究领域最具有潜力的一种遗传标记。目前，已经在多种水产养殖动物中报道了 SNPs分子标记，如凡纳滨对虾、日本牙鲆、虹鳟、大西洋鲑、牡蛎等。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla),在我国主要分布于长江口及以南沿海海域，是我国重要的海洋渔业资源和海水养殖蟹类。拟穴青蟹具有体型大、生长速度快、肉味鲜美等优点，深受广大消费者青睐。近年来，我国拟穴青蟹的人工养殖年产量一直稳定在10万吨以上，保持了健康的发展势头。学者们围绕拟穴青蟹繁殖生物学、养殖生物学等方面已经开展了较多的研究工作，但对遗传学及育种学方面的研究还较少。目前，在拟穴青蟹中已经开展了线粒体DNA和微卫星分子标记的研究，而对SNPs标记的研究还甚少，限制了群体遗传多样性评估、遗传图谱构建及分子标记辅助育种等研究的开展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，该方法具有实验周期短、成本低、操作简单等优点，能够准确地检测出不同个体的基因型，从而为拟穴青蟹分子遗传学及分子辅助育种研究提供新型遗传标记。本发明提供的20个SNPs分子标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源评估与保护及遗传连锁图谱构建等领域。本发明的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，包括(I)拟穴青蟹基因组DNA序列的获取基因组序列可以通过两种渠道获得第一，利用已经构建的拟穴青蟹基因组文库或转录组文库中的序列；第二，利用GeneBank数据库中的公开的拟穴青蟹功能基因序列。(2) DNA序列测序与候选SNPs鉴定首先，对所获得的基因组序列分段设计引物，PCR扩增产物大小在500bp、00bp之间为宜；其次，采用上述引物对5 30个无亲缘关系的拟穴青蟹个体进行PCR扩增；然后，选取扩增清晰、产量高、无非特异扩增的PCR产物送测序公司进行双向、直接测序；最后，对测序结果进行分析，比较不同个体在同一碱基位点的序列差异，鉴定出候选SNPs位点。
(3) SNPs验证与基因分型首先，针对每一个候选SNPs位点设计3条引物，包括2条等位基因特异的上游引物(Fl和F2)和I条通用的下游引物(R)。2条上游引物分别以SNP位点的2个不同的碱基作为引物的3’末端，并且在5’端分别加上长度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC);然后，以拟穴青蟹I个野生群体共30只个体的基因组DNA为模板，采用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，分析其溶解曲线的差异，若出现2条溶解曲线，表明该SNP位点是杂合型的；若出现I条溶解曲线，表明该SNP位点是纯合型的。由此，可获得不同SNPs位点在所有个体的基因型。所述步骤(2)中的引物共设计11对，其序列和退火温度如下第一对弓丨物FCAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火温度58 °C第二对弓I物F GTGAGCACTGGGCTGTATGRGGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火温度58 °C第三对弓丨物FACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火温度57 °C第四对引物FCCTGTTGACTGGGAGTGTCRAATGATGCAAGCCTAGTATGA退火温度56°C第五对引物FCAACATGTGTGACGACGAAGTRAGGATGGCGTAGGGAAGG退火温度60°C第六对引物FGCAGCATCATCTATATTTGTTCRGCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火温度59°C第七对弓丨物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火温度58°C第八对引物FTTTAGCACCATTAGGACTGRGAGGATGACCTGGAGAAG退火温度56°C第九对引物FTAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火温度56°C第十对引物FGAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火温度52°C
第^^一对引物FCACCTACCTTCTTCCTTCCAGTRCGGGGGTTGTCAAGAGTGT退火温度60°C本发明设计的拟穴青蟹20个SNPs分子标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源鉴定与保护及遗传连锁图谱的构建等方面。有益.效果(I)本发明的检测方法具有实验周期短、成本低、操作简单等优点，能够准确地检测出拟穴青蟹不同个体的基因型，从而为拟穴青蟹分子遗传学及分子辅助育种研究提供新型遗传标·记；(2)本发明提供的20个SNPs分子标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源评估与保护及遗传连锁图谱构建等领域。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11、拟穴青蟹基因组DNA序列的获得本实验室前期开展了拟穴青蟹转录组测序研究，本发明从中随机挑选不同的测序序列作为筛选SNPs的目标序列。2、序列测序与候选SNPs鉴定对上述挑选的序列设计PCR引物，产物的预期大小在500bp、00bp之间。以5个不同个体的DNA为模板，进行PCR扩增。将结果清晰、产量高、无非特异扩增的PCR产物送测序公司进行双向、直接测序。对测序结果进行拼接、比对，鉴定候选SNPs位点。3、SNPs验证与基因分型针对每一个候选SNPs位点设计3条引物，包括2条等位基因特异的上游引物(Fl和F2)和I条通用的下游引物(R)。2条上游引物分别以SNP位点的2个不同的碱基作为引物的3’末端，并且在5’端分别加上长度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC)。以拟穴青蟹I个野生群体共30只个体的基因组DNA为模板，采用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，分析其溶解曲线的差异。若出现2条溶解曲线，表明该SNP位点是杂合型的；若出现I条溶解曲线，表明该SNP位点是纯合型的。由此，成功筛选到拟穴青蟹20个SNPs分子标记(表1)，并获得了这些SNPs位点在每个个体的基因型数据。表I
权利要求
1.一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，包括(1)拟穴青蟹基因组DNA序列的获取；(2)对所获得的DNA序列设计引物，并在拟穴青蟹多个个体中进行PCR扩增，对扩增产物进行序列测定，再比较分析不同个体间序列差异，鉴定出候选SNPs位点；(3)针对候选SNPs位点设计等位基因特异引物，采用荧光实时定量PCR仪进行基因分型，并分析SNPs的基因型。
2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(I)中的拟穴青蟹基因组DNA序列来源于测序获得的基因组文库或转录组文库序列或GenBank数据库中公开的拟穴青蟹基因组序列。
3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的引物共设计11对，其序列和退火温度如下第一对引物F CAATGGCTGACGCTGCTACRGCGCTTGTTGGAGATATCG退火温度58°C ;第二对引物F GTGAGCACTGGGCTGTATGR GGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT退火温度58°C ;第三对引物F ACACGAAGTAACGAGCCGRGATGACCAAAGCAGCAAAA退火温度57°C ；第四对引物F CCTGTTGACTGGGAGTGTCR AATGATGCAAGCCTAGTATGA退火温度56°C ;第五对引物F CAACATGTGTGACGACGAAGTR AGGATGGCGTAGGGAAGG退火温度60°C ;第六对引物F GCAGCATCATCTATATTTGTTCR GCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA退火温度59°C ;第七对引物F GATGAAGGTCACGAGCAGARTGATGGCTGAAGCACAATAC退火温度58°C ;第八对引物F TTTAGCACCATTAGGACTGR GAGGATGACCTGGAGAAG退火温度56°C ;第九对引物F TAACGCACTAACAATTCTGCTRCAACCACATTCACTCATGGA退火温度56°C ;第十对引物F GAACAAGAGTTTGGCCTAGTRTCAATATCATCAGAGTTATTTTATT退火温度52°C ； 第i^一对引物F CACCTACCTTCTTCCTTCCAGT RCGGGGGTTGTCAAGAGTGT 退火温度60°C。
4.根据权利要求1所述的ー种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的PCR扩增需在5 30个不存在亲缘关系的个体中进行。
5.根据权利要求1所述的ー种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的测序方法为PCR产物双向直接测序。
6.根据权利要求1所述的ー种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中的候选SNPs的鉴定方法是通过比较分析不同个体测序峰图，寻找不同个体在相同DNA碱基位置上的单碱基突变位点，即为候选SNPs。
7.根据权利要求1所述的ー种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中的等位基因特异引物的设计方法为每个位点设计3条引物，包括2条长度不一的上游引物Fl和F2，且在其5’端分别连接长度不一的人工序列GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC ；1条下游通用引物R。
8.根据权利要求1所述的ー种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中的SNPs位点及其等位基因特异引物序列特征如下ScPaSNP28 F1 GCGGGCAGGGCGGCACTGGCCCACTGGTCGCF2 GCGGGCACTGGCCCACTGGCGGTRACACCAGGAAGGTCTTGTTGTCGTT ；ScPaSNP34 F1 GCGGGCAGGGCGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATCF2 GCGGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATTRTTGGATAGGATCACCGTCTGCTCGT ；ScPaSNP35 F1 GCGGGCAGGGCGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGACF2 GCGGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGATR TGGTAAATGAATTGTAATCCTCGTGCT ；ScPaSNP36 F1 GCGGGCAGGGCGGCGTGAGTGCGTCGTGTCTGGCF2 GCGGGCGTGAGTGCGTCGTGTGAGGARATGCAGATTGTATGGACTTTGACCTCC ；ScPaSNP39 F1 GCGGGCAGGGCGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCGF2 GCGGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCARCACAGTACAAAGACGTGGCCTCGAA ；ScPaSNP40 F1 GCGGGCAGGGCGGCGCCATAAGCAGCAGATAACCF2 GCGGGCAGCCATAAGCAGCAGATAATARCTTTGGTAGTCAGGTACTGCCTAAGTCA ；ScPaSNP41 F1 GCGGGCAGGGCGGCTCACCAGTGTGTGATGGCGF2 GCGGGCGTCACCAGGGTGTGATGGACRCCGACGTAGGCATCCTTCTGAC ；
全文摘要
本发明涉及一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，包括(1)通过测序获得的基因组文库或GenBank数据库获取拟穴青蟹基因组序列；(2)对获取的基因组序列进行引物设计，经PCR扩增后进行测序，对不同个体的序列进行比对并鉴定候选SNPs；(3)对候选SNPs位点设计等位基因特异的引物，采用实时荧光定量PCR的溶解曲线方法对SNPs进行验证与基因分型。本发明具有实验周期短、成本低、操作简单等优点，能够准确地检测出不同个体的基因型，从而为拟穴青蟹遗传变异分析、种群遗传多样性评估及分子标记辅助育种提供新型遗传标记。
文档编号C12Q1/68GK103045739SQ20121055968
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者马洪雨, 冯娜娜, 马凌波, 马春艳, 徐真 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所