质粒经行双 酶切。
[0050]pFastBac?HTA双酶切体系： pFastBac?HTA 2μL EcoRI 1μL PstI 1μL lOXFastDigestBuffer 2μL ddH20 14μL Total 20μL 37°C酶切5min.最后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果。紫外灯下切下目的产物 使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化以备连接用。
[0051] (2)次级片段亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 参考Luckow方法，将pFastBac?HTA线性载体与attacin目的片段进行连接，连接体系 如下： 1. 3. 2. 4 )重组Bacmid的制备 (1)转化到DHlOBacEcoli 将DHlOBac感受态细胞在冰上解冻，在超净台内将100μLDHlOBac感受态细胞转入1.5mLEppendorf管里，向其中加入上述连接产物20μL，轻轻混匀，冰上孵育30min;42°C 热休克45s(休克过程中勿晃动溶液)，然后立即置于冰上2min。加入室温的无抗生素的LB 液体培养基900μL，37°C，225rpm振摇4h。5,OOOrpm离心3min，弃去800μL上清后，轻柔 吹起沉淀，混匀；将已转化的感受态细胞吸取10 μL涂布于IPTG-X-gal筛选平板上，倒置平 板，37°C培养48h。
[0052] ⑵重组BacmidDNA的分离； (3)重组质粒的鉴定； 根据重组Bacmid DNA两端的M13引物序列位于LacZa互补区域内的mini_attTn7位 点的两侧，可对插入基因进行PCR鉴定。
[0053] PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分离的重组Bacmid DNA送大连宝生物测序鉴 定。
[0054] 1. 3. 3)Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 取冻存的家蝇胚胎细胞MDEC-07114,于37°C快速复苏后接种于一次性培养瓶中，用含 10%FBS、1%双抗的GPM-115培养基，5%C02, 28°C，孵箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长 期细胞进行实验。
[0055] 本研究发明采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统方法将课题组自制备的重组杆状 病毒Bacmid-pFastBac?-attacin转染家绳胚胎细胞，分别于实验开始、感染12h、48h、72h 观察细胞的形态变化，以常规方法培养细胞为实验对照组。
[0056] 1.3.4)重组病毒的扩增 扩增低滴度P1毒株，从而产生高滴度的毒株P2 (滴度为1X107pfu/mL到1X10spfu/mL)，在25mL培养瓶里接种入6X106个MDEC-07114细胞，活力>97%，新鲜GPM-115培养液 加至6mL，扩增病毒时加转染后的病毒上清60μL(M0I=0. 1)，28°C培育48h后，500Xg离心 5min，收集上清（P2)。
[0057] 1· 3· 5 )抗菌肽attacin的表达 将杆状病毒株P2转染家蝇胚胎细胞，转染时细胞要求同前，每6X106个MDEC-07114 细胞加病毒上清P2 3mL(M0I=5)，28°C培育72h后，500Xg离心5min，收集上清（上清总蛋 白），保存于-80°C备用。
[0058] 1. 3. 6 )表达产物attacin的提取、纯化 将细胞转移到Eppendorf管内，3, OOOrpm，离心5min，弃上清，预冷的一倍PBS洗涤，加 入lmL抽提试剂(含1 μ LDTT、10 μ LPMSF、1 μ L蛋白酶抑制剂);4°C，温育10min，漩涡中速震 荡；冰浴10min，期间漩涡剧烈震荡3-4次，每次30秒；12, 000g，4°C，离心5min，取上清(细 胞裂解物总蛋白）。用BCA法及SDS-PAGE分析分别测定、分析上清总蛋白、细胞裂解物总蛋 白及其各自采用亲和层析法（Ni-NTA亲和层析柱）纯化后的蛋白。
[0059] 1. 3. 7)目的蛋白的表达与鉴定 实验分6组(空白对照组、50yL P2感染组、100yL P2感染组、200 yL P2感染组、250 μ L P2感染组、500 μ L P2感染组），将生长于对数期的家蝇细胞接种于6孔培养板，每 孔2Χ 106个MDEC-07114细胞，按上述方法对各组细胞培养72h后，对培养上清进行蛋白提 取，纯化方法同前。取其中一部分目的蛋白进行Western blot检测，观察结果。另一部分 胶与NC膜紧贴进行转移电泳，后再进行转膜和ECL显影，扫描显影条带，用ImageJ分析软 件检测每个特异条带灰度值。
[0060] 1. 3. 8 )表达产物抗菌活性检测 采用大肠杆菌、纸片扩散法检测目的蛋白的抗菌活性。
[0061] 2 )结果 2. 1)成功构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体 成功构建含家绳抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体（Bacmid-pFastBac?-attac in)，并经测序证实； 2. 2)Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 用Bacmid对家绳细胞进行转染，分别于实验开始、感染后12h、48h、72h观察细胞的形 态变化，结果显示：对照组细胞形态无明显变化，细胞透亮，呈圆形、梭形及多边形，细胞生 长速度也无明显变化（图l、2);12h病毒组细胞体积增大；48h病毒组大部分细胞停止生长， 细胞不再增大，核显示不清，出现小泡，细胞核增大，部分充满细胞；72h病毒组细胞停止生 长，出现颗粒，部分从培养瓶脱离（图3-5)。
[0062] 2. 3)目的蛋白的表达、鉴定 杆状病毒感染家蝇胚胎细胞MDEC-07114的培养上清和细胞裂解物及通过镍柱纯化的 培养上清和细胞裂解物，经SDS-PAGE检测，在22KD附近出现了一条特异性条带，这与目的 蛋白的理论分子量21. 78KD基本一致（图6)。经BCA法测定，得到上清总蛋白含量浓度为 5. 5mg/mL，细胞裂解物总蛋白含量浓度为3.Omg/mL，上清纯化产物蛋白含量为0. 53mg/mL， 细胞裂解物纯化蛋白浓度为〇. 12mg/mL。 Westernblot检测转染72h后各组细胞上清纯化蛋白，各实验组灰度值明显高于对照 组，说明各细胞组上清均有抗菌肽attacin的表达（表1，图7-8)。
[0063] 表1不同数量病毒组的灰度值的变化 Tapi.Thechangesofgrayvaluefordifferentamountofvirusgroups
2. 4 )表达产物抗菌活性检测 家绳胚胎细胞表达抗菌肽attacin对大肠杆菌具有抗菌活性。
[0064] 3 )结论与分析 目前生物药物的市场需求远超于生产能力，工程细胞的优化、筛选对生物制药具有重 要影响。抗菌肽作为一类新的抗菌资源，来源有限，无法规模生产，通过基因工程技术生产 为理想手段。昆虫细胞-杆状病毒表达系统可以高效表达异源蛋白，是生产蛋白的重要工 具，但该表达系统中昆虫细胞系的研发稍显落后。因此，构建抗菌肽的昆虫细胞-杆状病毒 表达系统并使其高效表达意义重大。本发明以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，全基因合 成家绳抗菌肽attacin，制备重组杆状病毒Bacmid DNA (Bacmid-pFastBac?-attacin)转 染自行建立的家蝇胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达 系统，表达产物具有生物学活性，为抗菌肽attacin的生物学活性研究和家蝇胚胎细胞用 于抗菌肽的基因工程生产奠定基础，也为杆状病毒表达载体系统提供候选昆虫细胞系。
【主权项】
1. 家蝇胚胎细胞MDEC-07114构建抗菌肽attacin的杆状病毒真核表达系统表达产物 及构建方法 抗菌肽attacin通过构建的重组杆状病毒（Bacmid-pFastBacTM-attacin)在自建家绳 胚胎细胞MDEC-07114中得到表达，由于该家蝇胚胎细胞为本发明申请人独家拥有，实验证 实该细胞可作为抗菌肽的真核表达工具；经证实，抗菌肽attacin在该细胞中的表达这一 技术发明是首例；其特征在于：以家绳抗菌肽attacin为目标基因，全基因合成家绳抗菌肽 attacin克隆入PUC57质粒，重组质粒经双酶切后连接到pFastBac?HTA供体质粒，将制备 重组杆状病毒BacmidDNA(Bacmid-pFastBac?-attacin)转染自行建立的家绳胚胎细胞系 MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，表达产物经SDS-PAGE和 Western-Blot检测，证实抗菌肽attacin在家绳胚胎细胞表达成功，表达产物具有抗菌活 性。2. 家蝇胚胎细胞真核表达系统构建步骤及方法包括：其特征在于：（1. 1)细胞和质粒； (1. 2)主要试剂；（1. 3. 1)attacin基因合成、（1. 3. 2)家绳抗菌肽attacin重组杆状病毒 表达载体的构建及鉴定、（1. 3. 2. 1)attacin基因的合成、（1. 3. 2. 2)attacin克隆入质粒 PUC57、（1.3.2.3)attacin亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒、（1.3.2.4)重组Bacmid的 制备；（1. 3. 3)Bacmid转染至家蝇胚胎细胞；（1. 3. 4 )重组病毒的扩增；（1. 3. 5)抗菌肽 attacin的表达；（1.3. 6)表达产物attacin的提取、纯化；（1.3. 7)目的蛋白的表达与鉴 定；（1. 3. 8)表达产物抗菌活性检测（2. 1)成功构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒 表达载体；（2. 2)Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 ; (2. 3)蛋白含量测定；（2. 4)杆 状病毒目的蛋白的表达鉴定；构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体所表达产 物的这一结果及过程。3. 根据权利要求2所述的家蝇胚胎细胞真核表达系统构建步骤及方法，其 特征在于：所述的1. 1细胞和质粒为家蝇胚胎细胞系MDEC-07114、重组杆状病毒