一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业技术领域，更具体地，涉及一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及 其方法。
【背景技术】
[0002] 糯米糍是主产于广东广州、东莞和深圳等地的优良荔枝品种，果实鲜红色，较 大，单果重26. 5±3. 3g，果肉半透明，软滑多汁，味浓甜微带香气，种子多退化，可食率达 78. . 9±2. 9%，可溶性固形物18~21%，深受国内外消费者喜爱。然而，相对其他荔枝品种来 说，坐果低而且不稳是糯米糍生产上的一个突出问题，严重影响了该品种的产量和经济效 率。一般荔枝的坐果率达不到雌花数量的5%，而糯米糍的更低。最主要的原因是糯米糍果 实在发育的早期胚乳败育使得坐果不良。荔枝种子属于无胚乳种子，在种子发育前期种腔 充满液态胚乳随着胚的发育胚乳逐渐被胚吸收消耗，胚乳富含各种激素使种子成为代谢中 心，吸引养份供本身和果实的其他部分生长发育之用，所以胚乳的发育直接影响到胚的发 育进程。
[0003] 与其它胚乳早期发育良好的半败育品种如桂味、妃子笑和绿荷包等相比，糯米糍 的早期坐果率明显低，提高糯米糍的早期坐果率是提高糯米糍产量的重要措施。在生产上 一般采用提高树体营养如增施有机肥、喷施保果药剂2,4-D以及减少营养竞争如断根和环 割等措施来提高坐果率，农艺保果往往是提高坐果率的有效手段，然而，针对不同树势使用 时期较难把握，而2, 4-D常有药害和提高裂果率的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种提高糯米 糍荔枝坐果率的菌液及其方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液为含有沉默表达载体的ZcC/7基因片段转化获得的农杆菌工程菌。
[0006] 本发明通过病毒介导的基因沉默表达技术，将ZcC/7基因和病毒载体结合令 ZcC/7基因沉默表达，从而促进荔枝液态胚乳早期发育，提高荔枝得坐果率。
[0007] 优选地，所述ZcC/7基因片段的序列如SEQIDN0:1所示。
[0008] 优选地，所述沉默表达载体为pTRVl和pTRV2。
[0009] 本发明还提供一种提高糯米糍荔枝坐果率的方法，是利用所述菌液浸染荔枝植 株。
[0010] 优选地，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周前结有幼果的植株。
[0011] 优选地，所述菌液的〇D6。。为0· 5~1. 5〇
[0012] 优选地，所示浸染方法为喷洒、浸没。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，所述菌液为含有沉默表达载体的ZcC/7基因片段转化获得的农杆菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促进促进液态胚乳早 期发育，从而提高糯米糍荔枝的坐果率的技术。该方法适合工厂化生产调控剂，成本低，属 于短期基因表达干扰技术，无残留，不影响中后期果实生长发育，有较大的生产应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为TRV1 (a)和TRV2 (b)结构示意图；其中，RdRP为RNA依赖的RNA聚合酶； 16K为富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp为运动蛋白；Cp为衣壳蛋白；MCS为多克隆位点。 图2为实施例2处理组和对照组种子的形态结构。
[0015] 图3为对比例1菌液处理后结果。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0017] 实施例1浸染液制备 一、ZcC/7基因片段的克隆 以荔枝kC/冲勺500bp左右片段(序列如SEQIDN0:1)设计引物，并在引物前加上与PTRV2的及mHI和酶切位点同源的15 bp的载体序列接头，引物序列见下表1，PCR扩 增条件为94°C，2min;98°C，10s，55°C，30s，72°C，30s，30 个循环；72°C，lOmin。取2μ1 进 行琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收。
[0018] 二、病毒沉默载体pTRV2 (pYL156)的酶切 病毒沉默载体pTRVl(pYL192)，pTRV2 (pYL156)结构示意图如图1，选取pTRV2 (PYL156)上的及mHI和两个酶切位点对载体进行双酶切，限制性内切酶选用NEB(New EnglandBiolabs)公司的ifeazMHF和内切酶。反应体系为：pTRV2质粒1μg，内切 酶各 1yl，l〇XCutsmartBuffer5μL，用水补足至 50μL。于 37°C酶切 15 分钟，65°C 酶失活20分钟。酶切产物经酚氯仿抽提后，经2倍的无水乙醇和1/10体积的NaAc沉淀， 用75%的乙醇认真的洗两次后，将乙醇吹干。把酶切后的线性化质粒溶于20μ1的双蒸水 中备用。
[0019] 三、重组质粒的提取、连接、转化以及鉴定 利用GibsonAssembly?MasterMix(NewEnglandBiolabs)对步骤一纯化后的PCR扩增产物和步骤二得到的线性化载体进行连接，具体反应体系为：1μ1纯化回收的PCR 扩增产物，1μL线性化载体，4μL2XGibsonAssemblyMasterMix，用水补足8μ1〇 50°C反应半小时后取2μι转入50μι大肠杆菌DH5a感受态，测序鉴定结果正确的即为pTRV2-LcCIF重组质粒，扩摇提取质粒。
[0020] 四、利用冻融法将重组质粒转化农杆菌 取出100μ1GV3101农杆菌感受态细胞于冰上解冻，立即加入5μ1重组质粒DNA。 轻弹，冰上放置30min，液氮中冷冻5min，37°C水浴中温浴5min，冰上2min，加入无抗生 素的 500μL的YEP(AgrobacteriumGrowthMedium)液体培养基，28°C摇 3 ~4h。3000 r，离心3min，去培养基500μL，剩下的100μL全部均匀涂布于YEP固体培养基上（100 yllOOmgI1Kan, 50μL50mgllif)。28°C静止 2 ~3d。摇菌于含抗生素的（100 μL100mgl1Kan, 50μL50mgpRifOYEP培养基中，28°C，250rpm振荡过夜，菌液 PCR验证。
[0021] 五、质粒的大规模提取 挑取阳性克隆于500μ1含有100μgml1Amp的LB(Lysogenybroth，LB)液体培 养基中，过夜培养。转接100μ1菌液至10mlLB液体培养基37°C过夜培养，15，000g 离心1min收集菌体，按照每毫升菌体加： SolutionI100μ1 (冰浴 5min剧烈振荡） SolutionII200μ1 (冰浴 5min轻轻混勾） SolutionIII150μ1 (冰浴 5min轻轻混勾） Solution(I~III)参见分子克隆实验指南(莎姆布鲁克，美，2005)。
[0022] 15，000g离心5min，上清加入RNAse(10mgml3 37°C1h后加入等体积酸： 氯仿（1:1)，剧烈振荡后15，000g5min离心，取上清，加入等体积氯仿异戊醇，15，000 g，5min上清加1/10体积2. 5MNaAc和2体积无水乙醇，-20°C沉淀10min后，用75%乙 醇洗涤，晾干后加入适量适量双蒸水溶解。
[0023] 六、农杆菌的扩大培养以及侵染 每 100mlYEP培养基中加入 100μ1 100mgI1Kan, 50μ1 50mgI1Rif。挑取 单菌落至2ml离心管含有500μ1YEP培养基，后转入50ml离心管摇菌15ml，28°C， 200r.m，摇菌过夜。包括pTRVl和pTRV2-LcCIF两种菌。
[0024] 将第一天摇好的菌液，按1 :50或1 :25稀释到新鲜的YEP培养基中，每100mlYEP 培养基加入1ml1MMES(终浓度10mM)，10μ1乙酰丁香酮母液(终浓度20mM)，100μ1 100mg1 1Kan, 50μL50mg1 1Rif。500ml三角瓶摇菌 100-200ml，28°C，200rpm 摇菌过夜。
[0025] 3000g离心15min，倒掉培养基，用枪吹吸菌体使之均匀悬浮在侵染液中，吸 打混匀直至无块状。用分光光度计测重悬菌液浓度，使〇D6。。在1. 0~3. 0,将pTRVl和 pTRV2-LcCIF菌液按体积1 :1混合，暗处静置4~6小时。
[0026] 实施例2荔枝的农杆菌侵染处理 选取三株雌花盛开期的"糯米糍"作为实验材料，于3月19日（雌花盛花期）利用实施 例1制备得到的〇D_=l. 0浸染液进行喷花处理(处理组)，对照组为同样0D_的pTRVl和 PTRV2混合菌液进行喷花处理。处理后50天(第一和第二次生理落果后）对平均穗坐果率 和种胚发育情况进行调查。
[0027] 结果表明：与对照相比，处理组"糯米糍"荔枝的单果穗的挂果数明显增加，对照平 均单穗坐果为1. 68±0. 48个，而处理组则为2. 57±0. 45个，平均坐果数比对照提高53%。 花后50天，对照果实和种子平均重分别为1. 67±0. 07g和0. 293±0. 017g，处理组分别为 1. 66±0. 07g和0. 291±0. 016g，两者无明显差异，然而，从种子的形态看，处理组种子的内 腔明显大于对照种子(见图2)，荔枝果实发育种子种皮的大小决定于液态胚乳量，液态胚乳 量越多，种皮越大，这结果说明处理组果实液态胚乳的发育明显多于对照果实。
[0028]对比例1 试验方法同实施例2,唯一不同的是所用的浸染液的0D_=2. 5,喷花处理50天后，结果 表明：随着侵染液浓度的增加，处理组的挂果数并没有显著的增加，并且随着侵染液浓度的 增加，有提高落果率的风险(见图3)。
【主权项】
1. 一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液为含有沉默表达载体的 ZcC/7基因片段转化获得的农杆菌工程菌。2. 根据权利要求1所述的菌液，其特征在于，所述ZcC/7基因片段的序列如SEQ ID NO : 1所示。3. 根据权利要求1所述的菌液，其特征在于，所述沉默表达载体为pTRVl和pTRV2。4. 一种提高糯米糍荔枝坐果率的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述菌液浸染 蒸枝植株。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周 前结有幼果的植株。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌液的0D 6。。为0. 5~1. 5。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所示浸染方法为喷洒、浸没。
【专利摘要】本发明涉及农业技术领域，具体公开了一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法，所述菌液为含有沉默表达载体的<i>Lc</i><i>CIF</i>基因片段转化获得的农杆菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促进液态胚乳早期发育，从而提高糯米糍荔枝的坐果率的技术。该方法适合工厂化生产调控剂，成本低，属于短期基因表达干扰技术，无残留，不影响中后期果实生长发育，有较大的生产应用前景。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/08, A01G7/06
【公开号】CN105274136
【申请号】CN201510652694
【发明人】王惠聪, 张洁琼, 吴子辰, 刘恋, 赵杰堂, 黄旭明
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月10日