Bacmid-pFastBacTM-attacin由本寄生虫教研室自行建立和保存； 1. 2主要实验试剂为金普诺安昆虫细胞培养基（GPM-115) ;Cellfectin转染试剂；一 步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒、Ni-NTASefinoseTMResinKit、UNIQ-200柱式质粒中 量抽提试剂盒；胎牛血清（FBS);蛋白Marker;BCA蛋白定量试剂盒、考马斯亮蓝R-250、羊 抗鼠HRP标记二抗、羊抗兔HRP标记二抗；Anti-His(Abeam) ;GAPDH(Fermentas);NC膜、 发光液；吐温-20 ;显影粉、定影粉；大肠埃希菌44113自行保存； 1. 3. 1attacin基因合成 根据Genbank登录号AY460106的序列号，基因全长627bp; 1. 3. 2家绳抗菌肽attacin重组杆状病毒表达载体的构建及鉴定 1.3. 2. 1attacin基因的合成，基因全长627bp，并在Y和:V端分别加入EcoRI和PstI两个酶切位点； 抗菌肽attacin的基因序列GenBank登录号AY460106 : 1. 3. 2. 2attacin克隆入质粒PUC57 ⑴目的基因和质粒PUC57的双酶切及回收：用EcoRI、PstI对目的基因和PUC57质 粒进行双酶切，其中质粒含AMP抗性； PUC57质粒双酶切体系： PUC57 2uL EcoR I1μL Pst I1μL lOXFastDigest Buffer2μL ddH20 14μL Total20μL 37°C水浴酶切5min后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果； 紫外灯下切下目的产物使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化； (2)目的基因和质粒PUC57的反应连接： 将双酶切后目的基因和质粒HJC57的纯化产物按照摩尔比6:1混合，建立20μL的连 接反应体系，将各体系中溶液混匀，低温连接仪中16 °C反应18h; (3)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，提取质粒并测序： ① 转化： ② 摇菌：用枪头挑取阳性单菌落加至含4mLLB培养基的离心管，封口，37°C，150rpm振 摇 12h; ③ 提取质粒及鉴定： 1. 3. 2. 3attacin亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 (1)pFastBac?HTA质粒双酶切及回收：用EcoRI、PstI对pFastBac?HTA质粒经行双 酶切； pFastBac?HTA双酶切体系： pFastBac?HTA 2μL EcoR I1μL Pst I1μL lOXFastDigest Buffer 2μL ddH20 14μL Total 20μL 37°C酶切5min.最后通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定反应结果，紫外灯下切下目的产物 使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化以备连接用； (2) 次级片段亚克隆入pFastBac?HTA供体质粒 将pFastBac?HTA线性载体与attacin目的片段进行连接，连接体系如下： 1. 3. 2. 4重组Bacmid的制备 (1) 转化到DHlOBacEcoli 将DHlOBac感受态细胞在冰上解冻，在超净台内将100μLDHlOBac感受态细胞转入 1. 5mLEppendorf管里，向其中加入上述连接产物20μL，轻轻混匀，冰上孵育30min;42°C 热休克45s，休克过程中勿晃动溶液，然后立即置于冰上2min;加入室温的无抗生素的LB液 体培养基900μL，37°C，225rpm振摇4h;5,OOOrpm离心3min，弃去800μL上清后，轻柔吹 起沉淀，混匀；将已转化的感受态细胞吸取10μL涂布于IPTG-X-gal筛选平板上，倒置平 板，37°C培养48h; (2) 重组BacmidDNA的分离； (3)重组质粒的鉴定； 根据重组BacmidDNA两端的M13引物序列位于LacZa互补区域内的mini_attTn7位 点的两侧，可对插入基因进行PCR鉴定； PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，分离的重组BacmidDNA测序鉴定； 1.3. 3Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 取冻存的家蝇胚胎细胞MDEC-07114,于37°C快速复苏后接种于一次性培养瓶中，用含 10%FBS、1%双抗的GPM-115培养基，5%C02, 28°C，孵箱中培养，2-3天传代一次，取对数生长 期细胞进行实验； 本发明米用Bac-t〇-Bac杆状病毒表达系统方法将自制备的重组杆状病毒Bacmid-pFastBac?-attacin转染家绳胚胎细胞，分别于实验开始、感染12h、48h、72h观察 细胞的形态变化，以常规方法培养细胞为实验对照组； 1. 3. 4重组病毒的扩增 扩增低滴度P1毒株，从而产生高滴度的毒株P2,滴度为1X107pfu/mL到1X10spfu/mL，在25mL培养瓶里接种入6X106个MDEC-07114细胞，活力>97%，新鲜GPM-115培养液 加至6mL，扩增病毒时加转染后的病毒上清60μL(M0I=0. 1)，28°C培育48h后，500Xg离心 5min，收集上清（P2); L3· 5抗菌肽attacin的表达 将杆状病毒株P2转染家蝇胚胎细胞，转染时细胞要求同前，每6X106个MDEC-07114 细胞加病毒上清P2 3mL(M0I=5)，28°C培育72h后，500Xg离心5min，收集上清（上清总蛋 白），保存于-80°C备用； 1. 3. 6表达产物attacin的提取、纯化 将细胞转移到Eppendorf管内，3,OOOrpm，离心5min，弃上清，预冷的一倍PBS洗涤，加 入lmL抽提试剂含lyLDTT、10yLPMSF、lyL蛋白酶抑制剂；4°C，温育lOmin，漩涡中速震 荡；冰浴lOmin，期间漩涡剧烈震荡3-4次，每次30秒；12, 000g，4°C，离心5min，取上清(细 胞裂解物总蛋白），用BCA法及SDS-PAGE分析分别测定、分析上清总蛋白、细胞裂解物总蛋 白及其各自采用亲和层析法（Ni-NTA亲和层析柱）纯化后的蛋白； 1.3.7目的蛋白的表达与鉴定 实验分6组：空白对照组、50yLP2感染组、100yLP2感染组、200yLP2感染组、250μLP2感染组、500μLP2感染组，将生长于对数期的家蝇细胞接种于6孔培养板，每 孔2Χ106个MDEC-07114细胞，按上述方法对各组细胞培养72h后，对培养上清进行蛋白提 取，纯化方法同前；取其中一部分目的蛋白进行Westernblot检测，观察结果，另一部分胶 与NC膜紧贴进行转移电泳，后再进行转膜和ECL显影，扫描显影条带，用ImageJ分析软件 检测每个特异条带灰度值； 1. 3. 8表达产物抗菌活性检测 采用大肠杆菌、纸片扩散法检测目的蛋白的抗菌活性； 2. 1成功构建家蝇抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体 成功构建含家绳抗菌肽attacin基因的杆状病毒表达载体（Bacmid-pFastBac?-attac in)，并经测序证实； 2. 2Bacmid转染至家蝇胚胎细胞MDEC-07114 用Bacmid对家绳细胞进行转染，分别于实验开始、感染后12h、48h、72h观察细胞的形 态变化，结果显示：对照组细胞形态无明显变化，细胞透亮，呈圆形、梭形及多边形，细胞生 长速度也无明显变化；12h病毒组细胞体积增大；48h病毒组大部分细胞停止生长，细胞不 再增大，核显示不清，出现小泡，细胞核增大，部分充满细胞；72h病毒组细胞停止生长，出 现颗粒，部分从培养瓶脱离； 2. 3目的蛋白的表达、鉴定 杆状病毒感染家蝇胚胎细胞MDEC-07114的培养上清和细胞裂解物及通过镍柱纯化的 培养上清和细胞裂解物，经SDS-PAGE检测，在22KD附近出现了一条特异性条带，这与目的 蛋白的理论分子量21. 78KD基本一致；经BCA法测定，得到上清总蛋白含量浓度为5. 5mg/ mL，细胞裂解物总蛋白含量浓度为3.Omg/mL，上清纯化产物蛋白含量为0. 53mg/mL，细胞裂 解物纯化蛋白浓度为0. 12mg/mL; Westernblot检测转染72h后各组细胞上清纯化蛋白，各实验组灰度值明显高于对照 组，说明各细胞组上清均有抗菌肽attacin的表达； 2. 4表达产物抗菌活性检测 家绳胚胎细胞表达抗菌肽attacin对大肠杆菌具有抗菌活性； 以家绳抗菌肽attacin为目标基因，全基因合成家绳抗菌肽attacin，制备重组杆状病毒1^〇11丨(10嫩0^〇11丨(11?&8七1^〇1￥-&1^&(3；[11)转染自行建立的家绳胚胎细胞系]\0^007114， 构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统，表达产物具有生物学活性，和家蝇胚 胎细胞用于抗菌肽的基因工程生产，杆状病毒表达载体系统提供昆虫细胞系。
【专利摘要】本发明涉及一种家蝇胚胎细胞构建抗菌肽attacin真核表达系统所表达的产物及构建方法。以家蝇抗菌肽attacin为目标基因，重组杆状病毒Bacmid-pFastBacTM-attacin转染建立的家蝇胚胎细胞系MDEC-07114,构建抗菌肽attacin的家蝇胚胎细胞真核表达系统。全基因合成家蝇抗菌肽attacin，将目的基因attacin克隆入PUC57质粒，重组质粒经双酶切后连接到pFastBacTMHTA供体质粒，重组杆状病毒Bacmid？DNA；重组杆状病毒Bacmid？DNA转染家蝇胚胎细胞MDEC-07114中，提取培养上清和细胞裂解物粗蛋白，经镍柱纯化，SDS-PAGE和Western-Blot对蛋白表达进行检测、鉴定，对表达产物进行抗菌活性检测。
【IPC分类】C12N15/866, C07K14/435, A61P31/04
【公开号】CN105274143
【申请号】CN201510533418
【发明人】刘晖, 贺莉芳, 王灵军, 王鑫
【申请人】遵义医学院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年8月27日