专利名称：三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法
技术领域：
本发明涉及泥鳅鳍细胞的体外培养方法，特别是一种操作简单，可用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究的三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法。
背景技术：
泥嫩(MisgurnusanguiIIicaudatus)在分类学中属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus),是亚洲特有的野生小型淡水鱼类，广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本。我国各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水沟、稻田等均有分布。泥鳅肉质细嫩、味美，营养丰富，有“水中人参”之称，除了较高的食用价值，它还具有定的滋补药用功效，是市场上畅销的特种水产品之一。 除了具有重要经济价值外，泥鳅还是一种很好的细胞学、遗传学等方面的研究材料。三倍体泥鳅具有生长快、抗性强的特点，三倍体泥鳅鳍细胞可以满足对三倍体泥鳅生物学研究、病毒分离扩增、功能基因研究以及毒理学等应用研究的需要。但是，因为在鱼鳍细胞培养中容易出现微生物污染、细胞易漂浮、体外不易生长等问题，迄今为止还没有关于体外培养三倍体泥鳅鳍细胞的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、可用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究的三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法。本发明的技术解决方案是一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，其特征在于按如下步骤进行
a.制备细胞培养液
取DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml !在*!^的环境下存放；
b.原代培养
在工作台上取三倍体泥鳅的鳍组织，用质量浓度为10%的碘伏浸泡15分钟；再用青霉素和链霉素的混合液浸泡30分钟,青霉素浓度为500IU/ml,链霉素的浓度为500ug/ml ;再用PBS漂洗后，于5%FBS-DMEM/F12 (pH7. 2)中剪成O. 8^1. 2mm3的块状；经上述处理的鳍组织块均匀接种于25cm2细胞培养瓶中，在25°C C02培养箱中正置干贴24h后补加培养液至5ml/瓶，启动原代培养至细胞长成单层；
c.传代培养吸出培养瓶中的培养液，加入O. 25%的胰蛋白酶溶液1ml，5秒钟后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，消化5min，轻磕细胞培养瓶。将之前吸出的培养液加回，用吸管吹打，制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到新的两个培养瓶中；向两个培养瓶中补加a步骤所得培养液至5ml ;在25°C C02培养箱中培养至细胞长成单层。本发明步骤简单，易操作，克服了鱼鳍细胞培养中容易出现微生物污染、细胞漂浮、体外不易生长等问题，所培养的三倍体泥鳅鳍细胞的形态为纤维样，可以连续传代并直接应用于多倍体鱼生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究。
图I是本发明实施例经传10代的三倍体泥鳅鳍细胞镜下图。图2是本发明实施例所培养的细胞染色体镜下图。
具体实施方式
实施例I :
a.制备细胞培养液
选择Hyclone公司的DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml ;在4°C的环境下存放；
b.原代培养
将泥鳅用高双抗消毒曝气水(1000IU/mL青霉素，IOOOPg /mL链霉素)中暂养16 24h后，用含高双抗(1000IU/mL青霉素，IOOOPg /mL链霉素)的1%。的苯甲醇麻醉后在超净工作台上取三倍体泥鳅的鳍组织，用碘伏浸泡处理，碘伏浓度为10%，处理时间为15分钟；再用青霉素和链霉素的混合液进行浸泡处理，青霉素浓度为500IU/ml,链霉素的浓度为500ug/ml，处理时间为30分钟；再用PBS漂洗后，于少量5%FBS_DMEM/F12 (Ph7. 2)中剪成
O.8^1. 2mm3的块状经上述处理的鳍组织块均匀接种于25cm2细胞培养瓶中，在25°C C02培养箱中正置干贴24h后补加培养液至5ml/瓶，启动原代培养至细胞长成单层；
c.传代培养
吸出培养瓶中的培养液，加入O. 25%的胰蛋白酶溶液1ml，5秒钟后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，消化5min，轻磕细胞培养瓶。将之前吸出的培养液加回，用吸管吹打，制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到新的两个培养瓶中；向两个培养瓶中补加a步骤所得培养液至5ml ;在25°C C02培养箱中培养至细胞长成单层。可在细胞长成单层后重复c步骤进行多次传代培养，传10代的三倍体泥鳅鳍细胞如图I所示。实验
对本发明实施例所培养的细胞进行染色体分析
取实施例I培养的鳍细胞一瓶，加入秋水仙素，使其终浓度达lyg/ml，25°C继续培养2 4h后，按照c步骤中的方法将其制成细胞悬液，并收集于离心管中，IOOOrpm离心IOmin后弃上清，加入3ml预热的O. 075mol/mlKCl溶液用吸管吹打制成悬液在25°C下低渗30min, 1500rpm离心5min后弃上清，Carnoy固定液固定3次,每次15min,并放入_20°C冰箱中过夜，再以1500rpm离心5min —次后，加固定液Iml,滴片过火,用Giemsa染液扣染。对染色体制片中的中期分裂相，进行染色体数目统计，镜下图如图2所示，显示染色体数目为75条。结果证明所培养的细胞为三倍体泥鳅细胞。对实施例I培养的细胞冻存与复苏
配置Iml细胞冻存保护液分别取O. 2mlFBS, O. 6mlDMEM/F12和O. 2mlDMS0,混匀置于4 °C冰箱中备用。细胞冻存取所培养的处于对数生长期的细胞，经O. 25%胰蛋白酶消化后收获细胞，IOOOrpm离心IOmin后弃上清；向沉淀中加入所配置的Iml细胞冻存保护液,重悬细胞浓度至I X IO6个/ml，将细胞悬液转移到无菌冻存管中，并按以下程序降温4°C冰箱中放置30min、-20°C冰箱放置lh、_80°C冰箱过夜，最后放入液氮(_196°C )中长期保存。细胞复苏将水浴锅温度分别调至40°C和25°C，迅速把细胞冻存管从液氮罐中取出，放入40°C水浴中，待细胞冻存液溶化后转入25°C水浴中；然后无菌条件下将细胞冻存管中的细胞悬液转入离心管中，并加入等量的DMEM/F12培养液，IOOOrpm离心lOmin，去上清，收集细胞。用培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，25°C C02培养箱中培养，12h后全量换培养液，继续培养，4飞天后细胞即可长成单层。结果表明细胞经冻存复苏后仍能继续生长。·
权利要求
1.一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，其特征在于按如下步骤进行 a.制备细胞培养液 取DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml !在*!^的环境下存放； b.原代培养 在工作台上取三倍体泥鳅的鳍组织，用质量浓度为10%的碘伏浸泡15分钟；再用青霉素和链霉素的混合液浸泡30分钟,青霉素浓度为500IU/ml,链霉素的浓度为500ug/ml ;再 用PBS漂洗后，于5%FBS-DMEM/F12 (pH7. 2)中剪成O. 8^1. 2mm3的块状；经上述处理的鳍组织块均匀接种于25cm2细胞培养瓶中，在25°C C02培养箱中正置干贴24h后补加培养液至5ml/瓶，启动原代培养至细胞长成单层； c.传代培养 吸出培养瓶中的培养液，加入O. 25%的胰蛋白酶溶液1ml，5秒钟后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，消化5min，轻磕细胞培养瓶；将之前吸出的培养液加回，用吸管吹打，制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到两个新的培养瓶中；向两个培养瓶中补加a步骤所得培养液至5ml ;在25°C C02培养箱中培养至细胞长成单层。
全文摘要
本发明公开了一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，按如下步骤进行选择DMEM/F12培养基，并加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液；在工作台上取三倍体泥鳅的鳍并用碘伏、双抗等漂洗处理，在细胞培养瓶中进行原代培养；待细胞长成单层后制成细胞悬液并加入培养基进行传代培养。步骤简单，易操作；所培养的三倍体泥鳅鳍细胞的形态为纤维样，可以连续传代并直接应用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究。
文档编号C12N5/071GK102925407SQ201210477608
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者李霞, 马辰, 李雅娟, 秦艳杰 申请人:大连海洋大学