一种金柑三倍体的育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种金柑三倍体的育种方法，包括以下步骤：四倍体诱变、诱变种子的催芽培育、染色体倍性检查、四倍体植株的培育、四倍体果实采收和取种、四倍体种胚分离培养、种胚染色体检测和三倍体苗的培育。本方法避开有性杂交过程，排除珠心胚的干扰，直接从多胚性四倍体种子中分离培养出三倍体，具有操作简单、育种年限短的优点。
【专利说明】_种金柑三倍体的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于果树遗传育种【技术领域】，具体来说是涉及一种金柑三倍体的育种方法。
【背景技术】
[0002]金柑为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurant1ideae)金柑属(FortunellaSwingle)植物，金柑属共有6个种和I个变种。金柑为栽培种类的统称，一年可多次开花结果，果实色艳形美，营养丰富，有吉祥喜庆之寓意，是鲜食、加工和观赏的多用型果树。金柑属所有种均原产我国，然而目前栽培的金柑品种较少，鲜食类型只有金弹一种。阳朔金柑是目前栽培面积较大，经济效益较好的鲜食代表品种。
[0003]多倍体育种是果树育种的重要方法，多倍体果树具有植株生长旺盛、果大、无籽或少籽，产量高、同化物质含量高、适应性强和抗逆性强等特点，目前较有应用价值的多倍体是四倍体和三倍体，特别是三倍体果树，大多数高度不育，果实无核或少核，对提高果实可食率和加工品质具有重要的作用。
[0004]金柑的鲜食栽培品种均为多胚性，多胚性是有效获得杂种和三倍体品种的最大障碍，因此，传统的通过四倍体和二倍体杂交获得三倍体的途径在多胚性的金柑类品种中因珠心胚的干扰和种胚败育等因素的影响而难以实现。
[0005]本发明是利用多胚性品种先进行四倍体诱导，在四倍体种子中进行种胚分离培养，从而获得三倍体的方法。该方法较传统的胚乳培养、四倍体与二倍体有性杂交等方法简便易行，获得三倍体比例较高，避开了有性杂交、珠心胚干扰和种胚败育等障碍，可有效获得三倍体，缩短三倍体育种年限。该方法适用于多胚性金柑等柑橘类果树三倍体的获得。
[0006]现有技术中获得三倍体的途径，通常是采用四倍体和二倍体的有性杂交和胚乳培育等，其中，对于多胚性的果树由于珠心胚的干扰，难于获得三倍体，而胚乳培育获得三倍体的途径由于技术要求比较高、再生植株生长不良等因素，目前还没有成功获得三倍体栽培品种的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种金柑三倍体的育种方法。本发明提供的技术方案是:
[0008]一种金柑三倍体的育种方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0009](I)四倍体诱导:选择金柑成熟果实的饱满种子，去除外种皮，浸泡4_6h后将内种皮剥除，使种胚分离，然后将其置于0.1-0.2%浓度的秋水仙素溶液中浸泡24-48h ；
[0010](2)诱变种子的催芽培育:取出浸泡的种子，清洗后先在光照培养箱中催芽发根，保湿，待发根后，剪取l-2cm根尖置于卡诺氏固定液固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)中固定，依次编号，用做染色体倍性检测；
[0011](3)染色体倍性检查；
[0012](4)四倍体植株的培育:将步骤(3)中检查结果为四倍体的种胚编号选出，继续在沙盆中培养，待幼苗长出真叶，移栽到营养杯中，于温室内培养至第一次梢成熟后进行移栽;
[0013](5)四倍体果实采收和取种:对移栽后的四倍体植株按照金柑类果树的常规田间管理技术管理2-3年，待果实成熟即可采收，取种；
[0014](6)四倍体种胚分呙培养；
[0015](7)种胚染色体检测:待种胚生根，进行染色体倍性检查，检查方法同步骤(3);
[0016](8)三倍体苗的培育:将步骤(7)中检查为三倍体的种胚进行培育，培育的方法同步骤⑷。
[0017]作为优选，步骤(2)中卡诺氏固定液为按体积比95%乙醇:冰醋酸=3:1配制而成。
[0018]其中，步骤(3)所述染色体倍性检测包括以下步骤:
[0019]①预处理:将培养好的根尖剪下l_2cm，用0.002mol/L 8-羟基喹啉进行预处理2小时，用0.075mol/L KCL溶液进行前低渗20min，用lmol/L的盐酸在60°C水浴锅中解离7min，再转入0.075mol/L KCL中后低渗15min，在蒸馏水中浸泡1min ；
[0020]②改良卡宝品红液的配制:取原液C 10-20mL，加45 %乙酸溶液80_90mL、山梨醇1.8g，即配成10-20%改良卡宝品红液；
[0021]③染色体制片:将解离好的根尖用蒸馏水冲洗后放到载玻片上，切取约2mm的根尖分生组织，加I滴改良卡宝品红液染色6-10min，然后在显微镜下观察；
[0022]④染色体数目的确定:选择20-40个完整、染色体分散好和清晰的细胞进行染色体计数，确定染色体数目。
[0023]其中，步骤②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福尔马林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5 %石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g碱性品红溶于10mL的70%乙醇中所得。
[0024]其中，步骤(6)所述四倍体种胚分离培养包括以下步骤:
[0025]①将四倍体金柑种子洗净，放入烧杯中，加入适量的清水浸种l_2h ；
[0026]②取出种子，用镊子轻轻从种子的合点开始除去内外种皮，放入烧杯内，加入600倍的红汞溶液15-20min进行消毒；
[0027]③将已消毒的种子取出，浸入无菌水中30min后，种子的胚将自然松开；
[0028]④用镊子将未分离的种胚分开，置于培养皿中于28°C光温室中催芽，保湿。
[0029]与现有技术相比，本发明具有的有益效果是:
[0030]本发明的方法避开有性杂交过程，排除珠心胚的干扰，直接从多胚性四倍体种子中分离培养出三倍体，本方法操作简单，育种年限短。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0032]实施例:
[0033]本发明以金柑鲜食栽培品种“阳朔金柑”做诱变材料。具体步骤如下:
[0034](I)四倍体诱导:选择阳朔金柑成熟果实的饱满种子，去除外种皮，浸泡5h后将内种皮剥除，使种胚分离，然后将其置于0.2%浓度的秋水仙素溶液浸泡36h ；
[0035](2)诱变种子的催芽培育:取出浸泡的种子，清洗后先在光照培养箱中催芽发根，保湿，定期观察萌芽情况。待发根后，剪取Icm的根尖置于卡诺氏固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)中固定，依次编号，用做染色体倍性检测；
[0036](3)染色体倍性检查；
[0037](4)四倍体植株的培育:将步骤(3)中检查结果为四倍体的种胚编号选出，继续在沙盆中培养，待幼苗长出真叶，移栽到营养杯中，于温网室内培养至第一次梢成熟后移栽至高25cm、盆口直径40cm花盆中栽培；
[0038](5)四倍体阳朔金柑果实采收和取种:对移栽后的四倍体植株按照金柑类果树的常规田间管理技术管理，移栽后第二年开花结果，待果实成熟后采收果实，取种；
[0039](6)四倍体阳朔金柑种胚分离培养；
[0040](7)种胚染色体检测:待种胚生根，进行染色体倍性检查，检查方法同步骤(3);
[0041](8)三倍体阳朔金柑苗的培育:将步骤(7)中检查为三倍体的种胚进行培育，培育的方法同步骤⑷。
[0042]其中，步骤(3)所述染色体倍性检测包括以下步骤:
[0043]①预处理:将培养好的根尖剪下1cm，用0.002mol/L 8_羟基喹啉进行预处理2小时，用0.075mol/L KCL溶液进行前低渗20min，用lmol/L的盐酸在60°C水浴锅中解离7min，再转入0.075mol/L KCL中后低渗15min，在蒸馏水中浸泡1min ；
[0044]②改良卡宝品红液的配制:取原液C 10mL，加45%乙酸溶液90mL、山梨醇1.8g，即配成10%改良卡宝品红液；
[0045]③染色体制片:将解离好的根尖用蒸馏水冲洗后放到载玻片上，切取约2mm的根尖分生组织，加I滴改良卡宝品红液染色6min，用Leica DM-4000荧光显微镜观察、拍照；
[0046]④染色体数目的确定:选择20个完整、染色体分散好和清晰的细胞进行染色体计数，确定染色体数目。
[0047]其中，步骤②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福尔马林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5 %石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g碱性品红溶于10mL的70%乙醇中所得。
[0048]其中，步骤(6)所述四倍体种胚分离培养包括以下步骤:
[0049]①将四倍体阳朔金柑种子洗净，放入烧杯中，加入适量的清水浸种Ih ；
[0050]②取出种子，用镊子轻轻从种子的合点开始除去内外种皮，放入烧杯内，加入600倍的红汞溶液15min进行消毒；
[0051]③将已消毒的种子取出，浸入无菌水中30min后，种子的胚将自然松开；
[0052]④用镊子将未分离的种胚分开，置于培养皿中于28°C光温室中催芽，保湿。
[0053]经过调查和统计，本实施例中对“阳朔金柑”四倍体诱变率为12%，三倍体获得率为9% ο
[0054]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【权利要求】
1.一种金柑三倍体的育种方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)四倍体诱变:选择金柑成熟果实的饱满种子，去除外种皮，浸泡4-6h后将内种皮剥除，使种胚分离，然后将其置于0.1-0.2%浓度的秋水仙素溶液中浸泡24-48h ； (2)诱变种子的催芽培育:取出浸泡的种子，清洗后先在光照培养箱中催芽发根，保湿，待发根后，剪取l-2cm根尖置于卡诺氏固定液中固定，依次编号，用做染色体倍性检测； (3)染色体倍性检查； (4)四倍体植株的培育:将步骤(3)中检查结果为四倍体的种胚编号选出，继续在沙盆中培养，待幼苗长出真叶，移栽到营养杯中，于温室内培养至第一次梢成熟后进行移栽； (5)四倍体果实采收和取种:对移栽后的四倍体植株按照金柑类果树的常规田间管理技术管理2-3年，待果实成熟即可采收，取种； (6)四倍体种胚分尚培养； (7)种胚染色体检测:待种胚生根，进行染色体倍性检查，检查方法同步骤(3); (8)三倍体苗的培育:将步骤(7)中检查为三倍体的种胚进行培育，培育的方法同步骤⑷。
2.根据权利要求1所述的金柑三倍体的育种方法，其特征在于，步骤(2)中卡诺氏固定液为按体积比95%乙醇:冰醋酸=3:1配制而成。
3.根据权利要求1所述的金柑三倍体的育种方法，其特征在于，步骤(3)中所述染色体倍性检测包括以下步骤: ①预处理:将培养好的根尖剪下l_2cm，用0.002mol/L8-羟基喹啉进行预处理2小时，用0.075mol/L KCL溶液进行前低渗20min，用lmol/L的盐酸在60°C水浴锅中解离7min，再转入0.075mol/L KCL中后低渗15min，在蒸馏水中浸泡1min ； ②改良卡宝品红液的配制:取原液C10-20mL，加45%乙酸溶液80-90mL、山梨醇1.8g，即配成10-20%改良卡宝品红液； ③染色体制片:将解离好的根尖用蒸馏水冲洗后放到载玻片上，切取约2mm的根尖分生组织，加I滴改良卡宝品红液染色6-10min，然后在显微镜下观察； ④染色体数目的确定:选择20-40个完整、染色体分散好和清晰的细胞进行染色体计数，确定染色体数目。
4.根据权利要求3所述的金柑三倍体的育种方法，其特征在于，步骤②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福尔马林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5%石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g碱性品红溶于10mL的70%乙醇中所得。
5.根据权利要求1所述的金柑三倍体的育种方法，其特征在于，步骤(6)中所述四倍体种胚分离培养包括以下步骤: ①将四倍体金柑种子洗净，放入烧杯中，加入适量的清水浸种l_2h; ②取出种子，用镊子轻轻从种子的合点开始除去内外种皮，放入烧杯内，加入600倍的红未溶液15-20min进行消毒； ③将已消毒的种子取出，浸入无菌水中30min后，种子的胚将自然松开； ④用镊子将未分离的种胚分开，置于培养皿中于28°C光温室中催芽，保湿。
【文档编号】A01H1/08GK104488696SQ201410779338
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】黄桂香, 张树伟 申请人:广西大学