专利名称：双峰驼a-fabp蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocytefatty cid binding protein, A-FABP), 又称FABP4或ap2,是脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding proteins, FABPs)家族中的一员。其最早是在脂肪组织中被发现。A-FABP分布广泛，但主要是在脂肪细胞和巨噬细胞中表达。
人A-FABP基因定位于第8号染色体q21，小鼠A-FABP基因定位于第3号染色体， 猪A-FABP基因定位于4号染色体。猪A-FABP基因同人、小鼠和大鼠A-FABP基因序列相比， 分别有90%，83%及81 %的相似性。小鼠A-FABP基因4个外显子分别编码24，58，34和16 个氨基酸，3个内含子分别为2629，840，和471 bp。鸡A-FABP基因4个外显子也分别编码 24，58，34和16个氨基酸，3个内含子分别为I 240，224和I 284 bp。人A-FABP基因4个外显子亦分别编码24，58，34和16个氨基酸，3个内含子大小分别为2496，910，和498 bp。 对FABPs氨基酸组成进行比较分析发现，种间同型FABP具有较高相似性，并且这种相似程度大于同种不同型FABP相似性。
A-FABP蛋白通过影响脂代谢过程中的关键酶及其受体的表达，参与细胞内信号转导，在脂类的代谢和转运中起着重要作用。A-FABP可以结合各种细胞内脂肪酸，可能介导细胞腔隙间的脂质转运，也可以与激素敏感脂肪酶形成一个1:1的复合物，提高脂肪酶的效率，从而促进脂解和脂肪酸从脂肪细胞流出。此外，A-FABP可以调节脂肪和肌肉组织中脂肪酸的成分和利用率。动物实验表明A -FABP是动脉粥样硬化的主要介质。 Makowski和Boord等对载脂蛋白E (APOE) 2/2的小鼠模型的研究发现，不管给予小鼠高脂肪饮食还是低脂肪饮食，敲除A-FABP基因几乎可以完全保护小鼠不受动脉粥样硬化的危害。但给予I年的高脂肪的致动脉粥样硬化的饮食，AP0E2/2 A -FABP2/2组小鼠的幸存率为67%，明显高于AP0E2/2对照组，主要是由于动脉粥样硬化斑块的稳定性。 A-FABP与各种疾病的关系主要与其调节脂质和参炎症反应有关，与代谢综合征，2型糖尿病，多卵巢综合征，动脉粥样硬化和肿瘤进展关系密切。但其能否成为这些疾病的预测和临床诊断指标，有待深入研究；另外A-FABP与其他与代谢综合征关系密切的疾病， 如非酒精性脂肪肝的关系也有待研究。
在动物方面A-FABP基因遗传变异方面的报道较少，至今尚未发现克隆获得双峰驼A-FABP基因编码蛋白序列以及对动物A-FABP基因进化规律研究的报道。A-FABP在能量代谢，炎症反应起重要调节作用，和某些肿瘤的临床分期及病理分化程度有较好的对应关系，因此，通过对A-FABP从基因、蛋白质和抑制剂等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、II型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望。
双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节， 驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行能量代谢研究。发明内容
本发明提供了一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，A-FABP蛋白通过影响脂代谢过程中的关键酶及其受体的表达，参与细胞内信号转导，在脂类的代谢和转运中起着重要作用，本发明克服了上述现有技术之不足，提供了一种新的双峰驼 A-FABP蛋白的编码核苷酸序列，该序列是一种在能量代谢，炎症反应起重要调节作用的基因，通过对A-FABP从基因、A-FABP蛋白等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、II型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼A-FABP蛋白基因， 该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进上述重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。
上述重组蛋白为具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取； 第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
本发明双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节，驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行能量代谢研究。本发明通过克隆测序获得双峰驼 A-FABP基因的核苷酸序列，并对不同物种A-FABP基因的CDS序列进行同源性比较，了解和验证A-FABP基因的结构特点，为今后研究A-FABP基因与双峰驼脂类和能量代谢的关系提供基础资料。双峰驼A-FABP蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用，因此，通过对A-FABP从基因、蛋白等多方面的研究， 必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、II型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。
附图1为双峰驼A-FABP基因RT-PCR产物电泳图。
附图2为构建系统发生树所用A-FABP蛋白氨基酸同源性比较。
附图3为不同物种A-FABP氨基酸序列系统进化树具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述实施例1，一种双峰驼A-FABP蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。本发明中的双峰驼A-FABP蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA 为模板，参考牛、人、鼠等物种的A-FABP蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列。获得的双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。
可根据实际需要，对上述双峰驼A-FABP蛋白基因作进一步优化或/和改进 双峰驼A-FABP蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。在SEQID NO.1中，RT-PCR产物长度为944bp，电泳结果见附图1，其中70-72位为起始密码子 ATG，82 3-825位为终止密码子TGA，70-825位为编码蛋白质区域(CDS)。
实施例2，一种双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。
可根据实际需要，对上述双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。将双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA 序列中的编码序列(⑶S)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。
重组蛋白为具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；实施例3，一种双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，总RNA提取1. 组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation)(I)提取RNA的准备工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。
匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用O. 1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用O. 5%的SDS处理。
Tip头、EP管用O. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加O.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。
(2 )组织总RNA提取取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟。吸取上清液，15_30°C温育5分钟。 加O. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30°C温育2_3分钟。4°C 12000g离心15分钟。吸取上清液，加O. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g 离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。
(3)组织总RNA的鉴定通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用。琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液(2XTBE，13% 菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2 — 3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
第二步，引物设计及合成根据 GenBanK 发表的牛(Accession No: NM_001192410.1)、人(Accession No: BC003672.1)、马(Accession No: ΧΜ_001489404.1)等物种的 A-FABP 蛋白基因 mRNA 序列 ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼A-FABP蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼A-FABP蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 3(正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT 第三步，RT-PCR扩增按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer, lul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR 扩增条件97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环； 72°C延伸10分钟，4°C保存。
第四步，蛋白基因的克隆1、PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg 离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液， 静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
2、回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。
3、质粒的转化从一70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰·浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。 加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0. 1%(V/V) 的氨节青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒温培养10-15小时。
4、转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker—起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0. 1%(V/V)的青霉素钠(lOOmg/ ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
5、质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下 将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2 液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟.EP管中液体即为回收的质粒。
6、质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定·本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I 和Hin d II1.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul, Hin d III lul，10XK Buffer 2ul, DNA ( lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时。琼脂糖凝胶电泳检测.实施例4，重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
实施例5，双峰驼A-FABP蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼A-FABP蛋白基因编码序列同源性比较在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等17种动物的A-FABP蛋白基因编码蛋白序列， 将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示SEQ ID NO. 2序列与牛A-FABP蛋白氨基酸序列同源性为77. 00%。
2、A-FABP蛋白基因编码序列系统发生树构建在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等17种物种的17条A-FABP蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树 (见附图3)。结果显示双峰驼A-FABP蛋白基因同牛的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼A-FABP蛋白基因。
序列表
权利要求
1.一种双峰驼A-FABP蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的双峰驼A-FABP蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中70-825位的序列。
3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼A-FABP蛋白基因的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQID NO. 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼 A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼A-FABP蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼A-FABP蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGTGCGATGCGTTTGTGGGC-3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼A-FABP蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。通过克隆测序获得双峰驼A-FABP基因的核苷酸序列，并对不同物种A-FABP基因的CDS序列进行同源性比较，了解和验证A-FABP基因的结构特点，为今后研究A-FABP基因与双峰驼脂类和能量代谢的关系提供基础资料。双峰驼A-FABP蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它在能量代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此,通过对A-FABP从基因、蛋白等多方面的研究,必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、Ⅱ型糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/12GK103014005SQ20121047825
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司