使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒的制作方法

使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物基因工程【技术领域】，具体为一种使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒。本发明利用附着体载体表达靶向核酸内切酶，附着体载体可以实现非整合的稳定的基因表达，同时表达筛选基因；通过药物筛选可以除去没有得到质粒的细胞；当编辑完成后撤掉药物，细胞会逐渐丢掉附着体载体，这样就得到了不含外源基因的编辑细胞系。本方法延长了编辑的时间，提高了基因编辑效率。本发明还提供用于编辑细胞中特定染色体序列的试剂盒。本发明适用于各种真核生物细胞的基因组编辑。
【专利说明】使用编码靶向核酸内切酶附着体载体的基因组编辑方法及试剂盒发明领域
[0001]本发明属于遗传工程【技术领域】，具体涉及一种基因组编辑方法及试剂盒。

【背景技术】
[0002]基因组编辑技术(阴如邮6(11丨丨叩)是一种可以在基因组水平上对0嫩序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断0嫩，切断的0嫩在被细胞内的0嫩修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。0嫩修复系统主要通过两种途径修复0嫩双链断裂，即非同源末端连接和同源重组。通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因。1)基因敲除:如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生0嫩双链断裂，非同源末端连接修复的过程中往往会产生0嫩的插入或删除，造成移码突变，从而实现基因敲除特异突变引入:如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生双链断裂会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入定点转基因:与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在双链断裂修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。
[0003]目前比较流行的基因组编辑技术包括锌指酶技术(2111(31111016886,2刚)、转录激活物样效应物核酸酶技术狀丨1妨1:01'- 111^6 6^^601:01-1111016886, 和规律成族间隔短回文重复技术1111:61-81)806(181101-1: ^81111(11-011110 1~6^681:87 0^18^1^/0889) 0
[0004]锌指酶(2刚)由一个0嫩识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。0嫩识别域是由3-4个&82-11182锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。多个锌指蛋白串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列(9-12恥)，具有很强的特异性。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自的端的0嫩剪切域，它在二聚体状态时才有酶切活性。每个？0“单体与一个锌指蛋白组相连构成一个21^，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6-8恥),两个单体2刚相互作用产生酶切功能。从而达到0嫩定点剪切的目的。
[0005]I从册技术是在2刚技术之后发展起来的一种分子生物学工具。80(^^108(3011等人发现来自植物细菌1:11011101121881).的从⑶蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其祀位点的核酸序列有固定的对应关系。从⑶的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与八、6? X有恒定的对应关系，即^6识别丁，册识别0,?I识别八，剛识别I把这4种I从模块组装起来就可以特异结合任意的0嫩序列。仏謂成等用
模块代替2刚中的0嫩识别域，组装成新的基因组编辑工具即I从册(1^1 0^00^01-1111016886),实现了靶向基因组编辑的目的。
[0006]01？18？1？70389是最新出现的一种由八指导的0189核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，嫩(0^18^1^-(161-1^6(1 I？嫩)通过碱基配对与廿￡1(31觀八(I？嫩)结合形成双链I？嫩，此'觀八'觀八二兀复合体指导0狀9蛋白在⑶尺嫩引导序列靶定位点切断双链0嫩。在基因组编辑过程中，廿狀成嫩和⑶觀八可以融合成为1条八(8成⑷V，本发明中称之为向导八)表达同样可以起到靶向剪切的作用。0？13？1^0189的优点是操作简单，对基因组的效率高。需要对某一个靶位点编辑的时候，只需要表达相应的向导謂V即可，不需要对0^9核酸酶进行改造。但是最近的研究表明系统存在一定的脱靶剪切现象，阻碍了这种技术的广泛应用。为了克服脱靶剪切现象，麻省理工学院脑与认知科学助理教授、1060^6^脑研究所和81*0^1研究所核心成员？6叩2118118等人利用一种突变的只在0嫩上面产生单切口的内切酶018911( 0189-010八)和两个识别位点较近的向导I？嫩同时在细胞中表达，018911分别切开0嫩的两个链产生0嫩断裂，这就提高了特异性。
[0007]附着体载体是一类游离于染色体外并且可以在真核细胞内复制的0嫩质粒。目前比较流行的附着体载体包括如81:6111-831~1~ ^11-118 (￡87) , 81( ^11~118 (8^) , 130^11161)81)11101118 ^11~118 1 (8^^-1) , 811111811 ^11~118 40 (8740)衍生的质粒载体或者是是一类 3/嫩尺(808^^01(1/181:1-1^ ^1:1:80111116111: 1^6^1011, 3/嫩尺)介导的非病毒附着型载体。
[0008]￡8嫩1/01*1？是287复制和保持病毒基因组游离性有关的重要基因元件。￡8嫩1为28乂核抗原I的基因，编码一个磷酸化的和蛋白，蛋白的端为一个二聚化的0嫩结合区，￡8嫩1同源二聚化与0嫩上的特意序列结合。01*1？含有双对称性((173(1 87臟6廿7 08)和成簇的重复序列“116 ^111117 0？ 1-0^681:8,服)。这些序列包含于￡8嫩1结合位点。当￡8嫩1与这些序列结合后，使病毒基因组以稳定的游离体形式存在，并使病毒基因组依赖宿主复制的方式复制。鉴于￡8嫩1/01*1？的特点，％16在1985年首次将这两个基因元件引入质粒。具有￡8嫩1/01*1？质粒转染入靶细胞后不整合，可以长期稳定存在。
[0009]8.属于家族，￠101701118^11-11186 亚家族，1971 年首次在一位肾脏移植患者的尿液中分离。8.可以有效的感染哺乳动物细胞，并且保持病毒0嫩游离于宿主染色体之外。根据这个特性，将大I抗原和复制起始序列可以制成附着体质粒，用于稳定表达外源基因。如本文所用，术语“外源”指正常情况下不在这个染色体位置存在的任何序列。例如，外源序列可以是来自另一种生物体的“基因”、来自相同生物体的“基因”的另外的拷贝、人工序列、编码报道分子的序列等。？叩1110111狀11~11868在自然界广泛分布，在高等脊椎动物中常见。研究最深入的是8？7-1，它的基因组是一个小的环状双链0嫩，在细胞中可以维持20-300个拷贝数。8？乂-1编码的￡1和￡2蛋白，还有复制起始序列是维持病毒稳定存在必须的。根据这个原理可以制成附着体载体用于稳定表达外源基因。
[0010]第一个基于病毒制成的附着体载体是81111181140 (8740)衍生来的载体。这个载体含有0嫩复制所必须的3740携带的复制起始序列和它编码的大丁抗原。3740衍生的附着体载体复制不受宿主细胞控制，拷贝数可以达到上千，会导致细胞死亡。
[0011]最近10 年来，研发了一种 $/嫩I？ ($(?打01 IX1^6^1011, 8/]^^)介导的非病毒附着型载体。核基质附着区(脑廿IX 81:1:80111116111: 1*681011，嫩10又称为核骨架附着区(8(?打01(1 81:1:80111116111: 3八10序列是限制酶消化后仍附着在核基质上的0嫩序列，长度约为200-2 000恥；嫩1？富含八I碱基对0 7090。嫩I？元件在游离表达载体中具有三个功能性的特点，能够介导载体附着于染色体外存在，克服转基因表达的沉默和使载体在有丝分裂中保持稳定。
[0012]基因组编辑技术极大的扩展了改造基因的能力，但是编辑效率低的问题阻碍了该技术的应用。在易于编辑的册093细胞中编辑效率可以达到30%左右，但是在一些难于转染的细胞中效率低于10%，这为后面挑选两个基因拷贝删除带来了麻烦。目前基因编辑过程中主要通过编辑基因的瞬时表达完成，表达质粒转染两天后检测编辑效率。随着时间的延长细胞不断增殖而质粒不增殖，质粒会被稀释，因而编辑效率会被降低。另外，一部分细胞没有得到质粒，这也会影响整体的编辑效率。


【发明内容】

[0013]本发明的目的在于提供一种高效率的用于修饰细胞的基因组编辑方法及试剂盒，以实现体外培养细胞的高效率编辑。
[0014]本发明提供的用于修饰细胞的基因组编辑方法，使用了一种编码靶向核酸内切酶附着体载体，利用附着体载体表达靶向核酸内切酶；附着体载体可以实现非整合的稳定的基因表达，同时表达筛选基因，通过药物筛选可以除去没有得到质粒的细胞；当编辑完成后撤掉药物，细胞会逐渐丢掉附着体载体，这样就得到了不含外源基因的编辑细胞系。具体步骤为:
首先，构建一个附着体载体，编码靶向核酸内切酶和筛选基因(亦称抗性基因)；
然后，将所述附着体载体导入到细胞中，在药物的筛选下培养细胞若干天，使所有的细胞中都含有附着体载体并稳定表达靶向核酸内切酶。
[0015]本发明方法提高编辑效率的原理在于:(1)通过药物筛选富集了含有附着体载体的细胞42)长期培养增加了基因编辑的时间，从而提高编辑效率。
[0016]本发明中，所述附着体载体可以是如81:6111-8犯'(￡87),81((8^),130^1116 1101118 1 或 811111^1 40 (8740)等病毒附着型载体，也可以是3/嫩I？ (3(?打01 IX紅仏也腕]!!: 0681011，3/嫩10介导的非病毒附着型载体。这类0嫩载体的共同特征是能够在真核细胞中复制扩增。
[0017]本发明中，所述靶向核酸内切酶可以是锌指核酸酶(2刚 ?、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(1从册)或者规律成簇间隔短回文重复(01118^61-6(1
『6即1虹17 1111:61-81)806(1￠81111(11-011110 代押&匕)。
[0018]本发明中，所述靶向核酸内切酶在特定位置切断0嫩，细胞的0嫩修复系统通过非同源末端连接修复法或者同源重组修复法修复0嫩断裂。非同源末端连接修复法常常会产生碱基对的增加或者缺失，从而造成基因的移码突变。同源重组修复法需要提供额外的与0嫩断裂位点两侧有同源性的单链或者双链供体0嫩模版，0嫩模版上编码的信息会被拷贝到编辑位点。这种方法可以精确的改变基因序列，包括突变位点的引入或者改正，或者定点插入转基因。
[0019]本发明中，所述筛选基因可以是嘌呤霉素，新霉素，博来霉素，潮霉素等。
[0020]本发明中，所述细胞可以是培养的细胞、原代细胞、永生细胞、干细胞、诱导的多潜能干细胞(1%)或单细胞胚。
[0021]本发明中，所述细胞可以是人细胞、哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞或单细胞真核生物。
[0022]合适的细胞包括:真菌或酵母，如毕赤酵母(91(:11181)、酵母或裂殖酵母；昆虫细胞，如来自草地夜蛾(^)0(101) 1:01?打呢如虹也)的细胞或来自黑腹果蝇0)1X1801)111121 1116121110职81:610的32细胞；动物细胞，如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类或人细胞。
[0023]示例性细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是原代细胞。通常，可以使用对双链断裂敏感的任何原代细胞。这些细胞可以是多种细胞类型的，例如，成纤维细胞、成肌细胞、I或8细胞、巨噬细胞、上皮细胞等。细胞系可以是贴壁的或非贴壁，或可以使用本领域技术人员已知的标准技术，在刺激贴壁、非贴壁或器官型生长的条件下培育细胞系。合适的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢⑴讯))细胞、由^40转化的猴肾^1系(⑶37)、人胚肾系293、幼仓鼠肾细胞(8皿)、小鼠36代011细胞(114)、猴肾细胞((^1-76),非洲绿猴肾细胞(犯如)、人宫颈癌细胞(抱匕)、犬肾细胞(1000 4110^10大鼠肝细胞(81^3八)、人肺细胞(1138)、人肝细胞62)、小鼠乳腺瘤细胞(111)、大鼠肝瘤细胞￠110 3111/313细胞、人[2-03骨肉瘤细胞、人八549细胞、人1(562细胞、人册1(293细胞、人册1(2931细胞、人!￠1116细胞、人1(^-7细胞和狀1细胞。
[0024]对于所述附着体载体助181:6111-8211~1~ ^11*118 (即￡87系统)，本发明具体构建了如下几种质粒:28嫩 1 01896即？、28嫩 1 0189(30^？？、￡8嫩 1 0^8911(, ￡8^1 0189111? ；其中:
(一)28嫩1 0^8966？？附着体载体，含1131)0189内切酶、向导I？嫩表达系统(包括仙6启动子、后面的骨架I？嫩和它们之间的成嫩插入位点，即3叩1位点?、嘌呤霉素丨？!!!^)、绿色荧光蛋白6即？、质粒在真核细胞中复制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(八即)和复制起始点01-181110
[0025](二)￡8嫩1 0^89001)6？？附着体载体，含1^1)0189内切酶、向导I？嫩表达系统(包括匕服启动子、后面的骨架八和它们之间的成…V插入位点，即3叩1位点?、嘌呤霉素(户证。)、荧光蛋白⑶邱?？(⑶邱?？和嘌呤霉素通过？2八序列连接?、质粒在真核细胞中复制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因(八卹)和复制起始点
￠)110 01*1 尽 111。
[0026](三)本发明提供的￡8嫩1^8911(附着体载体，含1^1)0189内切酶、向导I？嫩表达系统(卜服启动子V插入位点，即3叩1位点，后面的骨架8^0、嘌呤霉素和1型单纯疱疫病毒胸腺喃唳核苷激酶11371-认的融合蛋白(叩:^!^)、质粒在真核细胞中复制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因(八卹)和复制起始点即0
[0027](四)28^10^891111(附着体载体，含11^)0189内切酶的突变体沾队狀如(产生但缺口切割?、向导八表达系统(卜服启动子成…V插入位点，即3叩1位点，后面的骨架八?、嘌呤霉素和1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶认的融合蛋白(叩抓让?、质粒在真核细胞中复制的元件￡8嫩1和￡87 01*1？、在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因(八卹)和复制起始点01-181110
[0028]￡8嫩1 0^8966？？附着体载体构建方法的具体步骤为:
(1)^9质粒用乂1^1和恥!!〗酶切，保留表达￡8嫩1基因部分。
[0029](2)序列人工合成并克隆到？即?9质粒的1^111和乂1^1位点，得到质粒
具体序列为:
661^001110^606^1060^61^011^6011^6^0060106^6600660^660066^100^6^
0^16^1^6^1^0^116^16^611166^0^00^0^01^6^160^616^^^160111^111616^11
161110^66110^66666^66161666^66111111^60^61^^00101^0^161661^166016^11^16^1006601600106060611106616^16^06616^^001016^0^0^160^60100066^6^06610^0^6011610161^6066^1600666^60^6^0^6000610^666060610^60666161166066616106660060^600^X6^66X06^0X0X^6^ (560.10.吣.0。
[0030]下划线部分分别为酶切位点恥111、^131、紅III和^1^1。
[0031](3) 口匕社丨⑶巧?!?质粒(来自美国？6叩2匕叩实验室)用88081酶切，替换为双3叩1酶切位点。双3叩1酶切位点用011职0^006^6^6^606^X60X01X06 (820.10.勵.2)和^006^6^60^X060X01X0X0 (820.10.勵.3)退火形成，正好可以连接到8811181酶切位点，得到质粒 1) 16=1:10^13？1？-3叩 I。
[0032](4 )用引物 I'八丁％！'八IX！'丁丁(820.10.勵.4 )和(^丁亿⑶⑶八!'⑶⑶60^0066601X60666X0^ (820.10.勵.5)把 0189 部分从？16社10？13？1？-3叩1 扩增下来，[即工、八8131酶切，连接到？诎?9-^上。
[0033](5)用引物⑶⑶以八(?八！'八(320.10.勵.6)和611011^611^01161^0^60106100^ (820.10.勵.7)把 6即？从？6即？州1 质粒上扩增下来，八8131、紅III酶切，连接到上述(4)中得到的质粒，得到￡8嫩1 0^96即？附着体载体。
[0034]￡8嫩1 ^900^？？附着体载体构建方法的具体步骤为:
611011^6106^011^110^60101^ (820.10.勵.9)将？2八⑶邱?？部分从丁2八—⑶邱?？ (8781:6111 810801611068)质粒扩增下来，八8131、八？III酶切，连接到￡8嫩101896即？质粒的八8131、紂III酶切位点，得到￡8嫩1 0^89001)6？？附着体载体。
[0035]￡8嫩1 0^8911(附着体载体构建方法的具体步骤为:
用弓丨物八八八?:八 1X6八八(:(^ ( 320.10.80.10 )和
611011^66016^10^606^60101^(820.10.勵.11)将 ￠1^01? 部分从 ^2/1^(:2-031(1-1)110?〈？8 III？如16丨6(1)质粒扩增下来，1^1*11、紅III酶切，连接到￡8嫩1质粒的尺81*11、紅III酶切位点，得到￡8嫩1 0^8911(附着体载体。
[0036]￡8嫩1 0^9111?附着体载体构建方法的具体步骤为:
通过点突变方法把￡8嫩1 0^8911(编码卜如&的的第29个碱基由八到0，得到￡8嫩108891111(附着体载体。
[0037]关于其余附着体载体:8.、8？乂-1、^40、3/嫩！？，可以根据实际需求，用上述类似方法构建。
[0038]本发明还进一步提供利用￡8嫩1 01896即？、28嫩1 0189⑶邱？？、28嫩1 0^8911(和￡8嫩1 01891111(附着体载体系统编辑细胞染色体的方法，这4种附着体载体系统使用方法相同，所以具体用￡8嫩1 0^8966？？附着体载体说明。根据编辑位点设计向导陬八，合成一对011叫，011叫退火后形成双链0嫩，并且末端和3叩1酶切￡8嫩1 0389166？？附着体载体产生的粘性末端匹配。用14 0嫩连接酶将双链0嫩片段连接到￡8嫩1 0^96即？附着体载体上，得到￡8嫩1 01896即？-成嫩。将￡8嫩1-成嫩导入到要编辑的细胞中，导入方法可以是常规的细胞转染试剂，如111X^6(3^11111112000，也可以用电转染的方式。转染两天后用适量浓度的抗性基因(亦称筛选基因)筛选细胞，把没有转染的细胞杀死。不同的细胞需要的抗性基因浓度不同，需要实现做浓度滴定，尽量用低剂量的药物筛选。编辑的时间会因为编辑位点和细胞类型而不同。通常情况下需要8-30天。检测编辑效率的方法可以用该领域经常用到的17酶或&1-1酶切法。编辑完成后将抗性基因撤除，细胞用流式细胞仪分出单克隆培养若干天，提取0嫩，编辑位点连接到I质粒载体上测序。在没有抗性基因筛选的情况下培养，附着体载体会逐渐从细胞中丢失。当使用￡8嫩1 018911(和￡8嫩1附着体载体时，编辑完成后撤除抗性基因培养3天，部分细胞在增殖过程中会丢掉附着体质粒，然后加更昔洛韦筛选5天，杀死含有编辑质粒的细胞，这样可以快速得到不含编辑质粒的细胞系。
[0039]附着体载体需要编码在真核细胞中起作用的抗性基因。在转染过程中一部分细胞没有得到质粒，需要通过药物筛选杀死这部分细胞，只允许得到质粒的细胞存活下来。另一方面，一部分细胞在分裂过程中附着体质粒会丢失，因此也需要依靠药物杀死这部分西胞。所述抗性基因可以是嘌呤霉素，新霉素，博来霉素，潮霉素等。
[0040]在同源重组时需要提供与酶切位点有同源性的供体0嫩，附着体质粒靶向核酸内切酶分子与供体载体的比率可以并且将变化。通常，附着体质粒与供体质粒的比率范围可以是约1:10至约10:1。在各个实施方案中，附着体质粒与供体质粒的比率可以是约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1 或 10:1。
[0041]靶向编辑染色体序列的频率可以并且将根据多种因素变化。在一些实施方案中，编辑的频率可以是大于约 0.1%、0.3%、1%、3%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%。可以使用本领域熟知的技术分离单一细胞克隆，其包含编辑的染色体序列。本领域技术人员熟悉用于产生对所编辑染色体序列纯合的细胞的方法。换而言之，细胞可以对所编辑的染色体序列是杂合或纯合的。
[0042]本发明还提供构建附着体载体基因编辑的试剂盒，该试剂盒中含有:
(1)编码靶向核酸内切酶和筛选基因的附着体载体；
(2)用于检测编辑位点的？(?的引物；
(3)14连接酶和连接缓冲液。
[0043]本发明试剂盒中，所述编码靶向核酸内切酶和筛选基因的附着体载体，可以是上述的287、8—、8？7-1、^40、3/嫩！？中的一种，这类0嫩载体的共同特征是能够在真核细胞中复制扩增。
[0044]本发明试剂盒中，所述靶向核酸内切酶可以是上述锌指核酸酶(2刚 ?、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶(从⑶吣或者规律成簇间隔短回文重复中的一种。
[0045]本发明试剂盒中，所述附着体载体助181:6111-8211~1~(即28乂系统)，具体可以是上述构建的几种质粒:￡8嫩1 01896即？、28嫩1 088911(, 088911(,
[0046]本发明适用于各种真核生物细胞的基因组编辑。

【专利附图】

【附图说明】
[0047]图1为本发明的4种附着体载体结构。其中，图1八展示了 ￡8嫩1附着体载体的结构，它是表达一个向导8嫩(成嫩)、一个0189蛋白、一个嘌呤霉素抗性基因(？111~0 )和一个绿色荧光蛋白(一即？)的附着体0嫩(四乂)系统。图18展示了 ￡8嫩1 0189。0邱？？附着体载体的结构，它是表达一个向导(成^0、一个￠^189蛋白、一个嘌呤霉素抗性基因(户!!!^)和一个荧光蛋白(⑶邱?？)的附着体0嫩(四乂)系统。图1(:展示了 ￡8嫩1 088911(附着体载体的结构，它是表达一个向导(成^0、一个￠^89蛋白、一个嘌呤霉素和抗性基因和1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶认的融合蛋白(叩抓让)的附着体载体(四乂)系统。图10展示了 ￡8嫩1 附着体载体的结构。与￡8嫩1 018911(附着体载体相比，它只在(^89编码区哈有一个010八突变，其余相同。01*1？是质粒在真核生物细胞内的复制起始位点序列，￡8嫩1编码的蛋白与01*1？序列相互作用起始质粒的复制。04是在原核生物中起作用的复制起始位点序列；如1？是氨苄抗性基因。
[0048]图2为在册1(293细胞中用￡8嫩1 0^96即？附着体载体编辑湖9位点的结果。图2八是检测编辑位点的序列，下划线部分是成嫩识别序列，红色标记是？八1序列，绿色部分是&101酶切位点。图28是产物的&101酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，8801位点就会被破坏，导致&^1无法切断。图2(:是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0049]图3为在册1(293细胞中用￡8嫩1 0^89001)6？？附着体载体编辑21X1位点的结果。图3八是检测编辑位点的序列，下划线部分是V识别序列，红色标记是？八1序列，绿色与红色部分是八861酶切位点。图38是？(?产物的酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，^61位点就会被破坏，导致无法切断。图3(:是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0050]图4为在册1(293细胞中用￡8嫩1 ^8911(附着体载体编辑⑶1X28位点的结果。图4八是检测编辑位点的序列，下划线部分是成嫩识别序列，红色标记是？八1序列，绿色部分是酶切位点。图48是？(?产物的酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，位点就会被破坏，导致无法切断。图4(:是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0051]图5为在册1(293细胞中用￡8嫩1 0^8966？？附着体载体编辑011*1八位点的结果。图5八是检测编辑位点的序列，下划线部分是V识别序列，红色标记是？八1序列，绿色与红色部分是80X1酶切位点。图58是产物的011*1八酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，011*1八位点就会被破坏，导致011*1八无法切断。图5(:是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0052]图6展示用￡8嫩1 0^8966？？附着体载体同时表达2个向导I？嫩(成嫩)的系统，用于同时编辑两个基因组位点。01-1？是质粒在真核生物细胞内的复制起始位点序列，￡8嫩1编码的蛋白与01*1？序列相互作用起始质粒的复制。01-1是在原核生物中起作用的复制起始位点序列；八1^是氨苄抗性基因。
[0053]图7为￡8嫩1 0^8966？？附着体载体在册1(293细胞中编辑011*1八和21X1位点的结果。图7八是产物的011*1八酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，011*1八位点就会被破坏，导致011*1八无法切断。图78是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。图7(:是产物的21X1酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，21X1位点就会被破坏，导致21X1无法切断。图70是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0054]图8展示了用￡8嫩1 0^891111(附着体载体同时表达2个向导I？嫩(成嫩)的附着体系统，这两个向导卩嫩距离很近，通过双切口产生0嫩双链断裂。01*1？是质粒在真核生物细胞内的复制起始位点序列，￡8嫩1编码的蛋白与01*1？序列相互作用起始质粒的复制。01-1是在原核生物中起作用的复制起始位点序列是氨苄抗性基因。
[0055]图9为在册1(293细胞中用图8质粒编辑21X1位点的结果。21X1位点与图3所述位点相同。图9八的下划线部分标明了两个成嫩序列，绿色部分是酶切位点。图98是产物的21X1酶切凝胶电泳图，用于检测编辑效率。如果所述位点被编辑，21X1位点就会被破坏，导致21X1无法切断。图％是编辑效率的定量图，纵轴是编辑的0嫩占总0嫩的百分比，横轴是编辑的天数。
[0056]图10为在册1(293细胞中用图6 ￡8嫩1 038966？？质粒删除21X1位点的一个281碱基对的结果。图104的下划线部分标明了两个成“V序列。图108是检测删除结果的？(?凝胶电泳图。删除片段第三天就可以检测到，并随着时间增加。

【具体实施方式】
[0057]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。
[0058]实施例1:利用￡8嫩1附着体载体编辑—基因座
以下实施例详述利用￡8嫩1附着体载体编辑—基因座，靶位点的序列为 5’ - ^6^6^0X^60X6^60X0X066 -3’ (820.10.勵.12),最后的序列是编辑所必须的？八1序列。20万个人册1(293细胞用1 ^ 8图1八所述￡8嫩1质粒转染。在孵育一日后，用21^/1111的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9和12天分别提取0嫩鉴定酶切效率。编辑的地方有一个&酶切位点((^(^扣)，已经用绿色标记出来(图2八)。编辑发生后这个位点被破坏，？⑶产物无法被&^1切开，从而通过酶切可以鉴定效率。由图28可以看出刚转染第1天编辑没有发生，靶位点完全可以被&^1切开.随着时间的推移越来越多的靶位点被编辑.到了第9天几乎100%的靶位点被编辑完成。
[0059]实施例2:利用￡8嫩1 0189⑶邱?？附着体载体编辑21X1基因座
以下实施例详述利用￡8嫩1 0^89001)6？？附着体载体编辑21X1位点。用如图18所示的￡8嫩1 0^89001)6？？附着体载体表达21X1的导向I？嫩。靶位点的序列为5’ -^6660X000^X0^0^X0^0066 -3’ (820.10.勵.13),最后的序列是 0^13？尺/0189 编辑所必须的？八1序列。20万个人册1(293细胞用1 ^ 8图1八所述质粒转染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、12、18天分别提取0嫩鉴定酶切效率。0？13？1^0189编辑的地方有一个八阴〗酶切位点(八，已经用绿色标记出来(图3八)。编辑发生后这个位点被破坏，？⑶产物无法被八861切开，从而通过酶切可以鉴定效率。由图38可以看出刚转染第1天编辑没有发生，靶位点完全可以被八阴1切开.随着时间的推移越来越多的靶位点被编辑.到了第18天几乎100%的靶位点被编辑完成。
[0060]实施例3:利用￡8嫩1 (^91?附着体载体编辑⑶1X28基因座以下实施例详述利用￡8嫩1 088911(附着体载体编辑现1吧8基因。用如图所示的￡8嫩1 088911(附着体载体表达⑶爪28的导向I？嫩。靶位点的序列为5’ -1X006^06^66X6600^X0^66 -3’ (820.10.勵.14),最后的八(? 序列是(^1^^/0189 编辑所必须的？八1序列。20万个人册1(293细胞用1 ^ 8图1八所述质粒转染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、12、18和22天分别提取0嫩鉴定酶切效率。0^13？尺/0189编辑的地方有一个酶切位点，已经用绿色标记出来(图4八)。编辑发生后这个位点被破坏，？⑶产物无法被切开，从而通过酶切可以鉴定效率。由图48可以看出刚转染第1天编辑没有发生，靶位点完全可以被1^1切开.随着时间的推移越来越多的靶位点被编辑.到了第22天65%的靶位点被编辑完成。
[0061]实施例4:利用￡8嫩1 0^8966？？附着体载体编辑011*1八基因座
以下实施例详述011*1八位点的编辑。用如图1八所示的￡8嫩1附着体载体表达01胱1八的导向I？嫩。靶位点的序列为5’- 00^X0X6^6600^60^60^X66 -3’ (820.10.^0.20 万个人册1(293 细胞用1^8图1八所述质粒转染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、12、18和22天分别提取0嫩鉴定酶切效率。0？13？1^0189编辑的地方有一个80X1酶切位点仏(:1(?)，已经用绿色标记出来(图5八)。编辑发生后这个位点被破坏，？⑶产物无法被80X1切开，从而通过酶切可以鉴定效率。由图58可以看出刚转染第1天编辑没有发生，靶位点完全可以被80X1切开.随着时间的推移越来越多的靶位点被编辑.到了第12天大约100%的靶位点被编辑完成。
[0062]实施例5:利用￡8嫩1附着体载体同时编辑011*1八和21X1基因座以下实施例详述在一个细胞中同时对011*1八和21X1位点的编辑。用如图6所示的
￡8嫩1 088966？？附着体载体同时表达01胱1八和21X1位点的导向I？嫩。20万个人冊1(293细胞用1^8图6所述质粒转染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、
12、15、18和22天分别提取0嫩鉴定酶切效率。由图7八可以看出转染后第18天011*1八位点编辑效率接近100%，转染后第22天21X1靶位点编辑完成90%。
[0063]实施例6:利用￡8嫩1 0^9111?附着体载体编辑21X1基因座
以下实施例详述利用双切口技术(如油匕11141118)编辑21X1基因座。如图8所示，￡8嫩1 0^891111(附着体载体表达21X1的两个导向I？嫩。这个载体表达的0189内切酶含有010八突变，只能在导向I？嫩引导下定点切割0嫩单链，两个距离合适的单链断裂可以形成0嫩双链断裂。这种方法需要两个靶位点同时切割才能产生突变，因而增强了切割的特异性。革巴位点的序列为5’- 160600^00661X6^X6X6^X66 -3，(320.10.勵.16)和51 -0^06^60^6600^16666^66 -3’ (820.10.^0.17)(见图恥)。20 万个人冊1(293 细胞用1 0 8图8所述质粒转染。在孵育一日后，用21118/1111的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、12、15、18和22天分别提取0嫩鉴定酶切效率。编辑的地方有一个八阴1酶切位点(八，已经用绿色标记出来(图9八)。编辑发生后这个位点被破坏，？⑶产物无法被八阴1切开，从而通过酶切可以鉴定效率。由图98可以看出刚转染第1天编辑没有发生，第22天靶位点编辑完成80%。
[0064]实施例7:利用￡8嫩1 0^96即？附着体载体在21X1基因座删除281碱基片段以下实施例详述利用￡8嫩1 0^8966？？附着体载体在21X1基因座敲除281碱基片段。如图6所示，￡8嫩1 0^8966？？附着体载体表达21X1的两个导向I？嫩，靶位点的序列为5’ -^660000^6X660X60X0X6666 -3’(320.10.80.18)-3’
(820.10.勵.19)(见图104)。20万个人册1(293细胞用1 ^ 8图8所述质粒转染。在孵育一日后，用2呢加1的嘌呤霉素筛选。第1、3、6、9、12、15、18、21、24、27和30天分别提取0嫩用？⑶初步鉴定酶切效率。由图108可以看出刚转染第1天编辑没有发生，第3天可以检测到0嫩片段删除，第12天后编辑基本上完成，单是仍然有部分没有编辑的0嫩条带。
[0065] 本发明中检测湖义位点的引物:
1601110111600166^0^0 (820.10.勵.20)
0X6X0^00^X00X6X0001 (820.10.勵.21)；
本发明中检测21X1位点的引物:
00^X00001X0X6X6^X61 (820.10.勵.22)
66^6^1X66^6^0^066^6^ (820.10.勵.23)；
本发明中检测011? 1八位点的引物:
66^60X66X0X61X66^6^ (820.10.勵.24)
1000^X00^X^X000^06X1 (820.10.勵.25)；
本发明中检测⑶爪28位点的引物:
0^66^66600^66^6^X1X6 (820.10.勵.26)
16^X06^66^X0X66606 (820.10.勵.27?0
【权利要求】
1.一种用于修饰细胞的基因组编辑方法，其特征在于具体步骤为: 首先，构建一个附着体载体编码靶向核酸内切酶和筛选基因； 然后，将所述附着体载体导入到细胞中，在药物的筛选下培养细胞若干天，使所有的细胞中都含有附着体载体并稳定表达靶向核酸内切酶。
2.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于所述附着体载体是病毒附着型载体:EBV、BKV、BPV-1或SV40，或者是非病毒附着型载体:S/MAR ;这类DNA载体的共同特征是能够在真核细胞中复制扩增。
3.根据权利要求1或2所述的基因组编辑方法，其特征在于所述靶向核酸内切酶是锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶或者规律成簇间隔短回文重复CRISPR/Cas9。
4.根据权利要求3所述的基因组编辑方法，其特征在于所述靶向核酸内切酶在特定位置切断DNA，细胞的DNA修复系统通过非同源末端连接修复法或者同源重组修复法修复DNA断裂。
5.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于所述细胞是培养的细胞、原代细胞、永生细胞、干细胞、诱导的多潜能干细胞或单细胞胚。
6.根据权利要求1所述的基因组编辑方法，其特征在于所述细胞是人细胞、哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞或单细胞真核生物。
7.根据权利要求6所述的基因组编辑方法，其特征在于所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、人胚肾系293、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、猴肾细胞、非洲绿猴肾细胞、人宫颈癌细胞、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞、大鼠肝瘤细胞、HIH/3T3细胞、人U2-0S骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞、人MCF-7细胞和TRI细胞。
8.根据权利要求3所述的基因组编辑方法，其特征在于所述附着体载体EBV系统，为如下几种质粒之一种:EBNA1 Cas9eGFP、EBNAl Cas9copGFP、EBNAl Cas9TK、EBNAl Cas9nTK ；其中: (-)EBNAl Cas9eGFP附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括:hU6启动子、后面的骨架RNA和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素，绿色荧光蛋白eGFP、质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (二)EBNAlCas9copGFP附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括:hU6启动子、后面的骨架RNA和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素、荧光蛋白copGFP，质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (三)EBNAlCas9TK附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统:hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk)、质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP,在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (四)EBNAlCas9nTK附着体载体,含有:hSpCas9内切酶的突变体hSpCas9n，向导RNA表达系统:hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型单纯疱疫病毒胸腺喃唳核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk),质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP,在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因(Amp)和复制起始点pUCorigin。
9.根据权利要求8所述的基因组编辑方法，其特征在于利用EBNAlCas9eGFP、EBNAlCas9copGFP、EBNAl Cas9TK和EBNAl Cas9nTK附着体载体系统编辑细胞染色体，其中，利用EBNAl Cas9eGFP附着体载体系统编辑细胞染色体的具体步骤为: 根据编辑位点设计向导RNA，合成一对oligo，oligo退火后形成双链DNA，并且末端和SapI酶切EBNAl CasOTeGFP附着体载体产生的粘性末端匹配用T4 DNA连接酶将双链DNA片段连接到EBNAl Cas9eGFP附着体载体上，得到EBNAl Cas9eGFP-gRNA ； 将EBNAl Cas9eGFP-gRNA导入到要编辑的细胞中，转染两天后用适量浓度的抗性基因筛选细胞，把没有转染的细胞杀死，编辑的时间为8-30天； 编辑完成后将抗性基因撤除，细胞用流式细胞仪分出单克隆培养若干天，提取DNA，PCR编辑位点连接到T质粒载体上测序，得到不含外源基因的编辑细胞系； 其中，所述抗性基因是嘌呤霉素，新霉素，博来霉素，或潮霉素； 利用EBNAl Cas9copGFP、EBNAl Cas9TK和EBNAl Cas9nTK附着体载体系统编辑细胞染色体步骤，与利用EBNAl Cas9eGFP附着体载体系统编辑细胞染色体的步骤相同。
10.一种用于编辑细胞基因组的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括: (1)编码靶向核酸内切酶和筛选基因的附着体载体； (2)用于检测编辑位点的PCR的引物； (3)T4连接酶和连接缓冲液； 其中，所述编码靶向核酸内切酶和筛选基因的附着体载体，是EBV、BKV、BPV-1、SV40、S/MAR中的一种，这类DNA载体的共同特征是能够在真核细胞中复制扩增； 所述靶向核酸内切酶是上述锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物核酸酶或者规律成簇间隔短回文重复CRISPR/Cas9中的一种。
11.根据权利要求10所述的用于编辑细胞基因组的试剂盒，其特征在于所述附着体载体 EBV 系统为下述质粒之一种:EBNAl Cas9eGFP、EBNAl Cas9TK、EBNAl Cas9TK、EBNAlCas9nT ;其中: (一)EBNAlCas9eGFP附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括:hU6启动子、后面的骨架RNA和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素，绿色荧光蛋白eGFP、质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (二)EBNAlCas9copGFP附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统，包括:hU6启动子、后面的骨架RNA和它们之间的gRNA插入位点即SapI位点，嘌呤霉素、荧光蛋白copGFP，质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP，在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (三)EBNAlCas9TK附着体载体，含有:hSpCas9内切酶，向导RNA表达系统:hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk)、质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP,在大肠杆菌中扩增质粒用的氨节抗性基因(Amp)和复制起始点pUC origin ； (四)EBNAl Cas9nTK附着体载体,含有:hSpCas9内切酶的突变体hSpCas9n，向导RNA表达系统:hU6启动子gRNA插入位点即SapI位点、后面的骨架RNA，嘌呤霉素和I型单纯疱疫病毒胸腺喃唳核苷激酶HSVlH的融合蛋白(purotk),质粒在真核细胞中复制的元件EBNAl和EBV oriP,在大肠杆菌中扩增质粒用的氨苄抗性基因(Amp)和复制起始点pUCorigin。
【文档编号】C12Q1/68GK104450785SQ201410733267
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】王永明, 麦瑞天, 陈少波 申请人:复旦大学