一组pcr鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法
【专利摘要】本发明公开了一组PCR鉴别引物，该组引物由三条引物组成，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明还提供以前述引物组鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。本发明提供的方法能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能实现与其他植物的鉴别。
【专利说明】-组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记【技术领域】，特别是涉及一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、 黄花白及的方法。
【背景技术】
[0002] 中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、 皮肤皲裂的治疗。历版中国药典收载均为兰科白及属植物白及Bletilla striata Rchb. f.，同时，白及作为珍稀濒危植物，野生资源匮乏，而栽培资源尚难以满足市场需求，使药 材价格逐年上涨。但由于该物种的分布具有地域性，一些地区性的中药材标准以黄花白及 B.ochracea Schltr.植物作为白及的替代药用品种（《贵州省中药材、民族药材质量标准》 (2003年版），《四川省中药材标准》（2010年版）），但作为地区性品种其资源使用受到一定 局限。发明人在对白及药材市场进行实地走访和调查发现，以黄花白及的块茎冠以正品白 及药材出售的现象极为普遍，而且以同属、同科植物块茎作为白及药材混淆使用的现象也 屡见不鲜。
[0003] 由于白及和黄花白及在非花期植物形态很难准确分辨，而且这2种物种的块茎在 表观性状、组织构造、理化成分上也极为相似，当块茎被加工为饮片、粉末时鉴别难度就更 大，既便是有丰富鉴定学知识和鉴别经验者也会筹措难定。白及B. striata Rchb. f.是国家 药典明确规定的中药白及品种，黄花白及的经济、药用价值与白及尚有一定差距。目前，运 用DNA分子标记技术对白及属植物进行鉴定上，有学者运用过SCAR分子标记方法对黄花白 及 B. ochracea Schltr.与白及 B. striata Rchb. f.、小白及 B. formosana Schltr.和云南 独蒜兰（又名独叶白蓝）Pleione yunnnanensis(Rolfe)Rolfe进行鉴定区别（赵爽，黄春 球，杨耀文，等.黄花白及的SCAR分子标记转化研究.中草药，2012,43 (10): 2036-2039)， 也有学者采用SRAP标记技术，拟探索建立一个分析白及物种遗传多样性的实验体系（蒋 瑞彬，徐旭栋，蓝小明，等.野生白及SRAP-PCR反应体系的优化，中华中医药学刊，2013， 31 (2) :353-355)，但以白及B. striata Rchb. f.为研究对象，将之与黄花白及和其他植物进 行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。本发明提供的一组PCR鉴别引物及以之鉴 别白及、黄花白及的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR扩增反应，即能快速、准确鉴定 白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药 材，并能实现白及和黄花白及与其他植物的鉴别。在提交本发明申请之前，尚无任何公开 或报道过本专利申请中所提及的PCR鉴别引物组及同步鉴别白及、黄花白及的分子鉴定方 法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一组PCR鉴别引物。
[0005] 本发明的另外一个目的在于提供上述鉴别引物组在白及、黄花白及鉴定中的应 用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一组PCR鉴别引物，其核苷酸 序列分别如序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 前述的PCR鉴别引物组在白及、黄花白及鉴别中的应用。
[0008] 包括前述引物的试剂盒。
[0009] -组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴 定样品的基因组DNA ;2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR 扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品 鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均 未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。
[0010] 具体的说，所述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，优选的， 所述的PCR扩增反应体系为25 μ L，包括Taq酶PCR预混液6?8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 2 ?5pmol，模板 DNA 20 ?160ng，CldH2O 补足 25 μ L。所述的 PCR 反 应程序为95°C预变性1?5min，25?40个循环（95°C变性1?20s、52?68°C退火延伸 1 ?30s)。
[0011] 更优选的，所述的PCR反应体系为25 μ L，包括Taq酶PCR预混液7 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 4pmol，模板 DNA 40ng，CldH2O 补足 25 μ L。所述的 PCR 反应程序为95°C预变性lmin，30个循环（95°C变性2s、66°C退火延伸5s)。
[0012] 一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，所述的步骤3)，其特征在于 对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测，在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白 及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出 条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。
[0013] 发明人进行了一系列实验，以优选本发明提供的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白 及、黄花白及的方法的PCR扩增条件等，证明本发明鉴定方法的有效性。具体技术方案如 下：
[0014] 一、引物设计
[0015] 在 NCBI (National Center for Biotechnology Information，NCBI，美国国立生 物技术信息中心）下载到白及与其近缘物种的核糖体基因序列和叶绿体基因序列，共246 条。另选用通用引物对白及与其近缘物种进行扩增并测序，成功获取50条rDNA-ITS序列 和15条psbA-trnH序列。运用ClustalX 2. 1软件对以上序列进行排序、比对、分析，找出白 及、黄花白及的特异性位点，针对此位点设计一组特异性鉴别白及和黄花白及的PCR引物， 该组引物由3条引物组成，其核酸序列分别如下：
[0016] SEQ ID NO. 1 :5'一GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3'
[0017] SEQ ID NO. 2 :5'一TTGGCACGGAGCGACACG-3'
[0018] SEQ ID NO. 3 :5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
[0019] 二、PCR扩增条件优选
[0020] 根据前述的鉴别引物组和扩增产物的Tm值、长度设置PCR扩增反应体系与扩增程 序，以白及、黄花白及和其近缘种（小白及、华白及）的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其 具体如下：
[0021] PCR 的反应体系为 25 μ L，包括Taq酶PCR预混液8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3 各 3pmol，模板 DNA 20ng，ddH20 补足 25 μ L。
[0022] 所述的PCR反应程序为95°C预变性lmin，35个循环（95°C变性20s，62°C退火延伸 30s)。
[0023] a.前述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及方法的PCR扩增程序优选 如下：
[0024] i退火延伸温度：考察了 48°〇、521：、561：、601：、641：、681：的退火延伸温度。结 果显示，52°C?68°C白及和黄花白及的扩增产物分别在354bp、519bp扩增出目的条带， 条带亮度随温度的升高而增强，近缘种均未检测出条带。为保证退火延伸的有效进行，本 发明选择退火延伸温度为66°C。图1为退火延伸温度优选的电泳检测图谱（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黄花白及、小白及、华白及）。
[0025] ii退火延伸时间：基于上述退火延伸温度的特征，考察ls、2s、5s、10s、20s、30s的 退火延伸时间。结果显示，各退火延伸时间下，白及、黄花白及均能有效扩增，条带亮度随着 时间的延长而增强，5s?30s条带亮度无明显差异。为节约时间，本发明优选退火延伸时间 为5s。图2为退火延伸时间优选的电泳检测图谱（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黄花 白及、小白及、华白及）。
[0026] iii变性时间：基于上述ii，考察变性时间为lS、2S、5 S、l〇S、15s、2〇S。结果显示， 各变性时间下，白及、黄花白及均能有效扩增，尤其是2s?IOs时条带亮度最强。为节约 扩增时间，本发明选择变性时间为2s。图3为变性时间优选的电泳检测图谱（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黄花白及、小白及、华白及）。
[0027] iv变性-退火延伸的循环次数（η):根据上述iii的特征，考察25、28、30、32、35、40 次变性-退火延伸循环次数对PCR扩增的影响。结果显示，各个循环次数条件下，白及、黄花 白及样品均能扩增，目的条带明亮清晰，尤其是在30次循环时的电泳条带亮度最均一。因 此，本发明优选变性-退火延伸的循环次数为30次。图4为变性-退火延伸循环次数优选 的电泳检测图谱（M:D2000DNA Marker ;1?4:白及、黄花白及、小白及、华白及）。
[0028] V基于上述iv，一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法PCR扩增程序 最终优选为：
[0029]
【权利要求】
1. 一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列为： SEQ ID NO. 1 ：5'-GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3' SEQ ID NO. 2 ：5'-TTGGCACGGAGCGACACG-3' SEQ ID N0.3:5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
2. 以权利要求1所述PCR引物组鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤： 1) 提取待鉴定样品的基因组DNA ; 2) 以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述的鉴别引物组对其进行扩增； 3) 对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。
3. 根据权利要求2所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，步骤2)所述的PCR 反应体系为 25 ii L，包括 Taq 酶 PCR 预混液 6 ?8 ii L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3各2pmol?5pmol，模板DNA20ng?160ng，ddH20补足25 y L。所述的PCR反应程序为 95°C预变性lmin?5min，25?40个循环（95°C变性Is?20s、52°C?68°C退火延伸Is? 30s)。
4. 根据权利要求3所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系 为 25iiL，包括 Taq 酶 PCR 预混液 7iiL，SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 各 4pmol， 模板DNA 40ng，ddH20补足25ii L。所述的PCR反应程序为95°C预变性lmin，30个循环（95°C 变性2s、66°C退火延伸5s)。
5. 根据权利要求2所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，步骤3)对步骤2)的 PCR扩增产物进行电泳检测，在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处 检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定 样品鉴定为其他植物材料。
6. 权利要求2?5任一项所述PCR扩增方法在白及、黄花白及鉴别中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104388569SQ201410733438
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】周涛, 赵丹, 黄璐琦, 袁媛, 肖承鸿, 江维克 申请人:贵阳中医学院, 中国中医科学院中药研究所