用于心脏病诊断和分型的超敏分子标志物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物标志物，具体涉及一种冠心病诊断和分型的超敏生物标志 物一一血清AhR分子及其在冠心病筛查与临床鉴别中的应用，属于检验医学、临床医学、生 物技术、生物化学及分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 冠心病（CAD)在全世界范围内尤其是在一些发展中国家拥有较高的发病率和死亡 率。据WHO预测，直至2030年，每年将会有23, 600, 000人死于心血管疾病。冠心病病理 学过程复杂，通常被认为是遗传和环境因子共同作用的结果。在过去几十年中，很多因素， 如吸烟、高血压、糖尿病（DM)、动脉硬化、肥胖和节食等被证实与冠心病有关，但冠心病的具 体发病机理仍不清楚。越来越多的证据说明炎症在冠心病的发病过程中扮演着重要作用， 其发病具有明显的家族聚集性，大量的遗传易感基因在疾病的发生发展过程中起着重要作 用，所涉及的条件十分复杂，该疾病确切的发病机制至今仍不清楚，从而限制了冠心病诊治 有效易感基因的发掘。
[0003] AhR是一种HLH PAS结合蛋白家族的转录因子，传统上被作为生物体环境毒性和 代谢酶的介导因子。近年来，一些研究逐渐显示该蛋白在心血管系统发育、功能形成和疾病 发生等过程发挥重要作用，例如通过AhR基因敲除小鼠的研究，发现小鼠罹患多种典型症 状，包括心肌肥大、血管重构和高血压等，而在ApoE缺失的动脉粥样硬化小鼠模型中，AhR 基因的激活诱导血管炎症的发生，并促进动脉硬化程度，以上结论均说明AhR受体在心血 管疾病的发生发展中具有重要影响，然而其对人类冠心病的系统作用机制及临床应用还少 见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于提供一种冠心病诊断和分型的超敏生物标志物，该生物标记物用 于冠心病筛查与临床鉴别具有高靶向性、稳定性、超灵敏的特点。
[0005] 本发明所述的检测冠心病的血清学生物标记物为血清AhR分子，该生物标记物 AhR所分离出的DNA分子包括：编码具有芳香烃受体活性的多肽的核苷酸序列，其基因表达 如SEQ ID N0. 4 ;所述多肽氨基酸序列如SEQ ID N0. 5。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述一种检测冠心病的血清学生物标记物AhR的 用途：作为用于制备判断冠心病发生的生物标志物试剂的应用，包括制备用于筛查冠心病 或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断、分子分型和生化检验的试剂、试剂盒。
[0007] 所述试剂盒包括引物系统、引物探针系统；所述引物系统由AhR的cDNA扩增引物 和锚定引物组成；所述引物探针系统由AhR的cDNA扩增引物和探针组成。所述AhR的cDNA 扩增引物为： 上游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 :5' -AITGTGCCGAGTCCCATATC-3' ； 下游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 :5' -AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3'。
[0008] 所述检测该标志物的技术包括但不限于荧光定量PCR技术或芯片法，或其他基因 检测的相关技术。
[0009] 所述AhR的探针由以下核苷酸序列（SEQ ID N0. 3)组成：（6-FAM) AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)〇
[0010] 所述荧光定量PCR技术为DNA染料法或TaqMan探针法。
[0011] 在采用荧光定量PCR检测方法时，使用特异性基因的AhR作为靶分子，其cDNA扩 增引物为： 上游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 :5' -AITGTGCCGAGTCCCATATC-3' ； 下游引物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 :5' -AAGCAGGCGTGCATTAGACT-3' ； 其探针核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 : (6-FAM) AGUUUUGCAUAGUUGCACUACA(MGB)〇
[0012] 本发明相对于现有技术的有益技术效果如下：本发明的生物标记物AhR分子与冠 心病的发生发展密切相关，利用AhR分子作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生 物标记物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确地预 测冠心病的早期发病情况、恶性程度及病理亚型。
【附图说明】
[0013] 图1 :冠心病组与对照组（Non-CAD)血清AhR水平比较（*#P〈0? 0001);图2 :四 种亚型冠心病：ST段抬高心肌梗死（STEMI)、非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI)、稳定性心绞 痛（SAP)和不稳定性心绞痛（UAP)，与对照组（Control)血清AhR水平比较（**P〈 0.01); 图3 :血清AhR基因水平诊断冠心病的R0C曲线。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如《分子克隆》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0015] 实施例1 受试群体：受试对象来自医院诊治的患者。
[0016] 冠心病患者入选标准：既往有心肌梗死病史，或者冠状动脉造影检查至少有一支 冠状动脉狭窄彡50% ;年龄大于18岁且小于80岁。
[0017] 排除标准：静息时有心绞痛；合并严重心力衰竭患者（EF〈 35%);合并严重瓣膜疾 病或心肌病患者。
[0018] -共选取冠心病组180例，非冠心病组169例，所有受试对象均签署知情同意书。 病例基本信息表见表1。
[0019] 表1病例基本信息表
[0020] 实施例2血液总RNA提取 (1) 红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的iox红细胞 裂解液(例如待处理的血液样品体积为200 yl，则取140 yl 10X红细胞裂解液)，用 RNase-free ddH20稀释至1 X红细胞裂解液； (2) 向1体积人类全血中加5倍体积IX红细胞裂解液(需自备合适的干净管子）；注 意：为获得最佳的混匀效果，血液和IX红细胞裂解液的混合液体积不应超过管子体积的 3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的裂解液RL 的使用体积也要进行相应调整； (3) 在冰上孵育10~15分钟，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次；注意：在孵育的过程中 溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20分钟； (4) 4°C 2, 100 rpm (~400Xg)离心10分钟，将上清完全去除；注意：离心后白细胞可 能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现 象会在随后的漂洗步骤中消失； (5) 向白细胞沉淀中加入IX红细胞裂解液(加入IX红细胞裂解液的体积是第1步 中全血用量的2倍)，重悬细胞； (6) 4°C，2, 100 rpm (~400Xg)离心10分钟，将上清完全去除；注意：如果上清去除不 完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低； (7) 向白细胞沉淀中加入裂解液RL (使用前加入巯基乙醇)，采用涡旋或使用移液 器混匀；如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RL 的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失； (8) 将溶液转移至过滤柱CS中(过滤柱CS放在收集管中)，12,000 rpm (~13,400Xg ) 离心2分钟，弃去过滤柱CS，收集滤液；注意：为避免气溶胶的形成，将移液器调整到多750 y 1以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现 象，造成难以吸取的情况； (9) 向滤液中加入1倍体积70%乙醇(通常为350 y 1或600 y 1 )，混匀(此时可能会 出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中（吸附柱CR2放入收集管中)，12, 000 rpm(~13,400Xg )离心30~60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱C