专利名称：河豚毒素高纯单体规模化制备方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物毒素的多级膜分离提取制备工艺，尤其涉及一种主要以河豚鱼卵巢或/和肝脏为原料进行规模化提取制备河豚毒素高纯单体的方法，属于天然生物毒素制品提取技术领域。
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是非蛋白小分子海洋神经毒素，是一种具有高特异性的钠离子通道阻断剂，大量的研究结果揭示，TTX在临床上可作为一种高效的局麻镇痛剂，能迅速拮抗吗啡类药物依赖的戒断综合症，其独特的生理活性功能和不凡的药理作用，潜在着巨大的医药开发价值。TTX的分子式C11H17N3O8分子量319.26，结构式为 河豚毒素的提取制备及纯化精制工艺国内外均有许多报道。概括起来主要有两种1、平田—后腾法(日本专利JP270719,1961)水溶液室温浸提→原液加热煮沸→过滤糊状物→弱酸树脂吸附→酸解吸→真空浓缩→活性炭吸附→有机溶剂解吸→真空浓缩→结晶→溶解→重结晶→干燥→粗品TTX→加苦味酸盐沸水溶解→热过滤→冷却结晶沉淀→热水中重结晶三次→TTX苦味酸盐→热水溶解→氨水调pH后冷却沉淀→沉淀水洗→醋酸溶解→氨水沉淀→TTX结晶。
2、王维国的树脂—活性炭层析法(中国专利CN1145225A，公告日1997.03.19)水溶液室温浸提→原液加热煮沸→过滤糊状物→弱酸树脂吸附→酸解吸→真空浓缩→活性炭柱层析→有机溶剂解吸→真空浓缩→结晶→溶解→重结晶→干燥→粗品。
这两种工艺均存在提取工艺过程复杂，功效低，产率低，纯度低且不稳定等问题。一方面冗长的工艺步骤，长时间的处理易使高蛋白含量的提取原液发酵发臭变质，无法进入规模化生产，尤其工艺中活性炭吸附步骤，由于吸附后不当的洗脱方法常常导致活性炭难以再生使用，同时由于存在不可逆吸附河豚毒素，其产率较低，另一方面产品纯度不高，且不稳定，导致临床需要安全有效的使用剂量难以控制，以及难以形成质量稳定的有规模的高纯河豚毒素晶体原料药的保障生产供给能力，成为河豚毒素规模化生产的主要技术障碍，亦严重影响和制约了河豚毒素在临床上的推广使用。
本发明的目的是提供一种分离效率与工效高、工艺维护与操作简单、产品的收率与品质高、运行费用低，适于规模化提取制备河豚毒素的方法。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的，以河豚鱼卵巢或/和肝脏为主要原料，采用多级连续自动膜分离系统组合技术规模化提取制备河豚毒素，最终产物为无臭无味的白色结晶纯品。LD50为5.67μg/Kg，纯度＞99％。
本发明具体的提取制备工艺步骤为1、原液制备取经匀浆的河豚鱼卵巢或/和肝脏，加入原料重量1～5倍的去离子水，控制PH2.5～7.5，在-2～15℃条件下进行成盐低温浸提，分离滤渣重复循环浸提2～4次，浸提时间分别控制12～20h。合并各次浸提液获得制备原液备用。
2、制备原液转入一级膜分离料罐，启动一级微滤膜分离系统装置，压力控制范围为0.15～0.8MPa，最好为0.2～0.5MPa，温度控制范围为10～50℃，微滤是以低压力为推动力，主要除去原液中的悬浮物和部分有机物与胶体类组分物质，透过液经管道进入二级膜分离料罐。
3、二级膜分离为超滤膜分离系统装置，以压力为推动力，利用高分子薄膜的选择渗透性，在常温下依靠一定的压差和流速，使小于膜孔径的含毒低分子量物质透过膜而使高分子量的蛋白质，氨基酸，多肽，酶等组分物质被有效截留，二级膜分离活性透过液直接进入三级超滤膜分离系统，进一步将分子量大于2000的非活性组分物质进行有效截留，操作压力控制范围为0.3～1.5MPa，最好为0.3～0.6MPa，温度控制范围为10～50℃，分离分子量范围为2×103～1×105，含毒活性透过液进入四级膜分离料罐。
4、四级膜分离为纳滤膜分离系统装置，膜表面孔径处于纳m级范围(10-9m)，分离的分子量范围为200～2000，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，最好为0.6～2.0MPa，PH为2.5～7.5。利用纳滤膜的功能特性，以压力为推动力，将分子量大于350的非活性组分物质进行高效截留，高活性含毒透过液进入五级膜分离料罐。
5、五级膜分离为反渗透膜分离系统装置，以压差作为操作推动力，工作压力为0.8～6.0MPa，最好为1.4～1.8MPa，温度控制10～50℃，pH2.5～7.5，利用反渗透膜的功能特性，对经过四级纳滤膜分离的高活性含毒透过液进行高效的脱水浓缩。收集经反渗透膜浓缩截留的高毒活性液进一步经真空浓缩至小体积备用。
6、往高毒分离液中加入氨水调节pH8～10，2～15℃条件下静置得沉淀物河豚毒素结晶。然后经高效液相制备色谱精制，真空冷冻升华干燥，得到纯品河豚毒素晶体。
上述微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜分离的膜材料为高分子材料膜或无机材料膜或它们的共混膜、复合膜；具有成膜性的有机高分子材料均可以选择为成膜材料，如有机氟、有机氯材料；聚砜、聚芳砜及其改性材料；聚烯烃、聚丙烯腈及其共聚物材料；纤维素及其改性材料；聚酰胺类材料；聚酯、聚碳酸酯及其改性材料等等。例如聚酯、聚碳酸酯纤维素、聚酰胺、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚砜醋酸纤维素、聚砜酰胺、聚芳砜、聚醚酰胺、聚偏氟乙烯、磺化聚砜、甲基丙烯酸甲酯与丙烯腈共聚物、芳香聚酰胺、聚呱嗪类、磺化聚醚、聚砜、磺化聚芳醚砜、芳香聚酰胺、纤维素和改性纤维素、聚芳醚酮、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯腈—丁二烯共聚物、聚醚酰亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、氯甲基化聚砜聚醚酮以及它们的共混物或复合物。无机膜材料可以是多孔性陶瓷、多孔性玻璃、多孔性金属等。
所说的微滤膜分离的膜材料其截留悬浮微粒类物质的粒子粒径范围为5～100μm.
所说的超滤膜分离的膜材料其截留分离物质的分子量范围为2×103～1×106。
所说的纳滤膜分离的膜材料其截留分离物质的分子量范围为2×102～2×103。
所说的反渗透膜分离的膜材料其截留分离物质的分子量范围为200～400。
上述的规模化提取制备河豚毒素的工艺可用于河豚毒素其它衍生物的提取制备。
本发明采用微滤、超滤、纳滤和反渗透等多种前沿膜分离技术高效组合协同作用，取得了吨级大体积活性提取液在常温或相对低温条件下的有效分离和快速浓缩的关键技术突破。分离或浓缩工效根据需要可在每h数十Kg级至数百Kg级作出选择，显著降低了成本，同时显著提高了产率。特别是高效的分离效率，使河豚毒素含量仅为百万分之几的低毒原料亦可加以利用。这在目前已见报道的工艺中是无法达到的。本工艺采用膜分离技术使分离除杂与脱水浓缩同时进行，不仅效率显著，而且可以避免基于热效应转换的浓缩过程有效活性组分可能存在的损失，也避免了基于载体填料吸附、解吸、载体反复再生处理等繁杂操作和造成二次污染；避免了过滤助滤剂的使用，降低生产成本，提高产物收率＞10％。膜过程进行液料浓缩可以节约能源70％以上，降低生产成本8％以上。
据报道记载常见的河豚鱼品种有40余种，河豚鱼不仅鱼体各部分含毒量差别极大，尤其不同种类的河豚鱼含毒量的差异十分显著，原料的巨大差异使进行规模化提取制备河豚毒素存在相当大的难度，特别对于低含毒量的原料，若没有高分离效率工艺的配套，则无法进行生产。本发明以运行无相变的多级膜分离技术组合协同作用，显著提高了分离效率，使含毒量为百万分之几的低毒河豚鱼卵巢或肝脏原料亦可加以充分利用。
本发明的另一显著优点是大大提高工效，缩短生产周期，传统2天的工艺过程可以在6h内完成，而且工艺维护、操作简单，运行费用低，节省大量人力和物力资源，做到高效节能。膜分离工艺可以高效、分步去除提取液中的蛋白质、氨基酸、肽类、脂类、多糖类、胆固醇以及核酸、甾体类、磷脂类和盐类物质，因此容易进行整体物料的综合利用。膜分离工艺可以实现全封闭运行，易于自动化控制，提高产品的收率和品质。保障操作人员的安全。因此，本发明提出的规模化生产方法是TTX提取的重大技术突破。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例11、取100Kg河豚鱼卵巢，经匀浆后采用成盐低温循环浸提制备原液，浸提溶媒酸化去离子水150Kg(PH＝4)。浸提温度10℃，浸提周期每循环18h，合并2次循环提取液，得制备原液。
2、将制备原液转入1号料罐，启动一级聚四氟乙烯微滤膜分离系统装置，控制压力0.40MPa，在常温条件下运行。被截留的料液返回1号罐，分离至原液料液体积为1/2时，加去离子水顶洗至截留料液检测无TTX组分即停止。将透过液转入2号料罐备用。
3、启动二级磺化聚砜超滤膜分离系统装置，控制压力0.3MPa，在常温条件下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级超滤膜分离系统装置，截留料液返回2号料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加去离子水顶洗至截留部分料液无TTX组分检出即终止。并回收截留组分作为其它综合利用料液。然后，将含毒活性透过液转入3号料罐备用。
4、启动四级聚呱嗪酰胺复合纳滤膜分离系统装置，控制压力0.8MPa，控制温度30℃，截留料液返回3号料罐进入循环分离。至循环料液无TTX组分检出时终止。回收截留组分作为综合利用料液，将高活性含毒透过液转入4号料罐备用。
5、启动五级芳香聚酰胺反渗透膜分离系统装置，控制工作压力1.0MPa，温度控制35℃，透过液循环至浸提工序再利用。收集经该级膜浓缩截留的高毒活性液，进一步经真空低温浓缩至1000mL备用。
6、往高毒浓缩液中加入氨水调节PH9，10℃条件下静置，得沉淀物河豚毒素结晶。经离心分离出晶体用4％醋酸溶解，再经高效液相制备色谱精制，得纯品河豚毒素，转入真空冷冻升华干燥，获得白色河豚毒素纯品晶体。
实施例21、取150Kg河豚鱼肝脏，经匀浆后采用成盐低温循环浸提制备原液，浸提溶媒酸化去离子水150Kg(pH＝5)。浸提温度5℃，浸提周期每循环15h，合并4次循环提取液，得制备原液。
2、将制备原液转入1号料罐，启动一级聚硫酸酯纤维素微滤膜分离系统装置控制压力0.3MPa，在常温条件下运行。被截留的料液返回1号罐，分离至原液料液体积为1/2时，加去离子水顶洗至截留料液无TTX组分检出即停止。将透过液转入2号料罐备用。
3、启动二级聚砜酰胺超滤膜分离系统装置，控制压力0.5MPa，在25℃温度条件下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级超滤膜分离系统装置，被截留的料液返回2号料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加去离子水顶洗至截留料液无TTX组分检出即终止。并回收截留组分作为其它综合利用料液。然后，将含毒活性透过液转入3号料罐备用。
4、启动四级芳香聚酰胺复合纳滤膜分离系统装置，控制压力1.2MPa，控制温度30℃，被截留的料液返回3号料罐进入循环分离。至循环料液无TTX组分检出时终止。回收截留组分作为综合利用料液，将高活性含毒透过液转入4号料罐备用。
5、启动五级醋酸纤维素反渗透膜分离系统装置，控制工作压力1.5MPa，温度控制40℃，透过液弃去。收集经该级膜浓缩截留的高毒活性液，进一步经真空低温浓缩至1500mL备用。
6、往高毒浓缩液中加入氨水调节pH8.5，2℃条件下静置，得沉淀物河豚毒素结晶。离心分离出的晶体用5％醋酸溶解，再经高效液相制备色谱精制，得纯品河豚毒素，转入真空冷冻升华干燥，获得白色河豚毒素纯品晶体。
实施例31、取300Kg河豚鱼卵巢，经匀浆后采用成盐低温循环浸提制备原液，浸提溶媒酸化去离子水360Kg(pH＝2.5)。浸提温度2℃，浸提周期每循环20h，合并3次循环提取液，得制备原液900～1000Kg。
2、将制备原液转入1号料罐，启动一级聚酰胺微滤膜分离系统装置，控制压力0.2MPa，在常温条件下运行。截留料液返回1号罐，分离至原液料液为1/3体积时，加去离子水顶洗至截留料液检测无TTX组分即停止。将透过液转入2号料罐备用。
3、启动二级聚芳砜超滤膜分离系统装置，控制压力0.7MPa，在常温条件下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级超滤膜分离系统装置，截留料液返回2号料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加去离子水顶洗至截留料液无TTX组分检出即终止。并回收截留组分作为其它综合利用料液。然后，将含毒活性透过液转入3号料罐备用。
4、启动四级混合型复合纳滤膜分离系统装置，控制压力1.8MPa，控制温度40℃，截留料液返回3号料罐进入循环分离。至循环料液无TTX组分检出时终止。回收截留组分作为综合利用料液，将高活性含毒透过液转入4号料罐备用。
5、启动五级聚砜反渗透膜分离系统装置，控制工作压力2.0MPa，温度控制45℃透过液弃去。收集经该级膜浓缩截留的高毒活性液，进一步经真空低温浓缩至2000mL备用。
6、往高毒浓缩液中加入氨水调节至PH9，5℃条件下静置，得沉淀物河豚毒素结晶。经离心分离出的晶体用5％醋酸溶解，再经高效液相制备色谱精制，得纯品河豚毒素，转入真空冷冻升华干燥，获得白色河豚毒素纯品晶体。
实施例41、100Kg河豚鱼卵巢和50Kg河豚鱼肝脏，经破碎后采用成盐低温循环浸提制备原液，浸提溶媒去离子水450Kg(pH＝7)。浸提温度15℃，浸提周期每循环20h，合并3次循环提取液，得制备原液。
2、将制备原液转入1号料罐，启动一级聚丙烯微滤膜分离系统装置，控制压力0.8MPa，在15℃条件下运行。截留料液返回1号罐，分离至原液料液为1/2体积时，加去离子水顶洗至截留料液检测无TTX组分即停止。将透过液转入2号料罐备用。
3、启动二级聚偏氟乙烯超滤膜分离系统装置，控制压力1.2MPa，在15℃条件下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级聚芳砜超滤膜分离系统装置，截留料液返回2号料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加去离子水顶洗至截留料液无TTX组分检出即终止。并回收截留组分作为其它综合利用料液。然后，将含毒活性透过液转入3号料罐备用。
4、启动四级磺化聚(醚)砜复合纳滤膜分离系统装置，控制压力5.0MPa，控制温度25℃，截留料液返回3号料罐进入循环分离。至循环料液无TTX组分检出时终止。回收截留组分作为综合利用料液，将高活性含毒透过液转入4号料罐备用。
5、启动五级芳香聚酰胺反渗透膜分离系统装置，控制工作压力6.0MPa，温度控制30℃透过液弃去。收集经该级膜浓缩截留的高毒活性液，进一步经真空低温浓缩备用。
6、高毒浓缩液中加入氨水调节至PH8.5，8℃条件下静置，得沉淀物河豚毒素结晶。经离心分离出的晶体用4％醋酸溶解，再经高效液相制备色谱精制，得纯品河豚毒素，转入真空冷冻升华干燥，获得白色河豚毒素纯品晶体。
实施例51、取50Kg河豚鱼卵巢和50Kg河豚鱼肝脏，经匀浆后采用成盐低温循环浸提制备原液，浸提溶媒去离子水500Kg(pH＝7.5)。浸提温度12℃，浸提周期每循环15h，合并2次循环提取液，得制备原液。
2、将制备原液转入1号料罐，启动一级聚氯乙烯或聚酯微滤膜分离系统装置，控制压力0.6MPa，在20℃条件下运行。被截留料液返回1号罐，分离至原液料液为1/2体积时，加去离子水顶洗至截留料液检测无TTX组分即停止。将透过液转入2号料罐备用。
3、启动二级甲基丙烯酸甲酯与丙烯腈共聚物超滤膜分离系统装置，控制压力1.5MPa，在30℃条件下运行。二级超滤膜分离活性透过液直接进入三级聚砜酰胺超滤膜分离系统装置，截留料液返回2号料罐，当被分离料液体积缩小至1/3体积时，加去离子水顶洗至截留料液无TTX组分检出即终止。并回收截留组分作为其它综合利用料液。然后，将含毒活性透过液转入3号料罐备用。
4、启动四级聚砜复合纳滤膜分离系统装置，控制压力3.0MPa，控制温度40℃，截留料液返回3号料罐进入循环分离。至循环料液无TTX组分检出时终止。回收截留组分作为综合利用料液，将高活性含毒透过液转入4号料罐备用。
5、启动五级聚酰胺反渗透膜分离系统装置，控制工作压力4.0MPa，温度控制40℃透过液弃去。收集经该级膜浓缩截留的高毒活性液，进一步经真空低温浓缩备用。
6、往高毒浓缩液中加入氨水调节至pH9，12℃条件下静置，得沉淀物河豚毒素结晶。经离心分离出的晶体用4％醋酸溶解，再经高效液相制备色谱精制，得纯品河豚毒素，转入真空冷冻升华干燥，获得白色河豚毒素纯品晶体。
权利要求
1.河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于制备工艺步骤为1)、原液制备取经匀浆的河豚鱼卵巢或/和肝脏，加入原料重量1～5倍的去离子水，控制pH 2.5～7.5，在-2～15℃条件下进行成盐低温浸提，分离滤渣重复循环浸提2～4次，浸提时间分别控制12～20h，合并各次浸提液获得制备原液备用，2)、制备原液转入一级膜分离料罐，启动一级微滤膜分离系统装置，压力控制范围为0.15～0.8MPa，温度控制范围为10～50℃，以低压力为推动力，除去原液中的悬浮物和部分有机物与胶体类组分物质，透过液经管道进入二级膜分离料罐；3)、二级膜分离为超滤膜分离系统装置，以压力为推动力，利用高分子薄膜的选择渗透性，在常温下使小于膜孔径的含毒低分子量物质透过膜而使高分子量的蛋白质，氨基酸，多肽，酶组分物质被有效截留，二级膜分离活性透过液直接进入三级超滤膜分离系统，进一步将分子量大于2000的非活性组分物质进行有效截留，操作压力控制范围为0.3～1.5MPa，温度控制范围为10～50℃，分离分子量范围为2×103～1×105，含毒活性透过液进入四级膜分离料罐；4)、四级膜分离为纳滤膜分离系统装置，膜表面孔径处于纳米级范围(10-9m)，分离的分子量范围为200～2000，操作压力控制范围为0.5～5.0MPa，pH为2.5～7.5。利用纳滤膜的功能特性，以压力为推动力，将分子量大于350的非活性组分物质进行高效截留，高活性含毒透过液进入五级膜分离料罐；5)、五级膜分离为反渗透膜分离系统装置，以压差作为操作推动力，工作压力为0.8～6.0MPa，温度控制10～50℃，pH2.5～7.5，利用反渗透膜的功能特性，对经过四级纳滤膜分离的高活性含毒透过液进行高效的脱水浓缩。收集经反渗透膜浓缩截留的高毒活性液进一步经真空浓缩至小体积备用；6)、往高毒分离液中加入氨水调节pH8～10，2～15℃条件下静置得沉淀物河豚毒素结晶，然后经高效液相制备色谱精制，真空冷冻升华干燥，得到纯品河豚毒素晶体。
2.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于一级微滤膜分离系统装置的压力控制范围为0.2～0.5MPa。
3.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于所说的二级至三级超滤膜分离系统的操作压力控制范围为0.3～0.6MPa。
4.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于所说的纳滤膜分离系统装置的操作压力控制范围为0.6～2.0MPa。
5.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于所说的反渗透膜分离系统装置的工作压力为1.4～1.8MPa。
6.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜分离的膜材料为高分子材料膜或无机材料膜或它们的共混膜、复合膜；具有成膜性的有机高分子材料为成膜材料，如有机氟、有机氯材料；聚砜、聚芳砜及其改性材料；聚烯烃、聚丙烯腈及其共聚物材料；纤维素及其改性材料；聚酰胺类材料；聚酯、聚碳酸酯及其改性材料；无机膜材料是多孔性陶瓷、多孔性玻璃、多孔性金属。
7.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于截留悬浮微粒类物质的粒子粒径范围为5～100μm。
8.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于所说的超滤膜分离的膜材料的截留分离物质的分子量范围为2×103～1×106。
9.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于所说的纳滤膜分离的膜材料的截留分离物质的分子量范围为2×102～2×103；所说的反渗透膜分离的膜材料的截留分离物质的分子量范围为200～400。
10.如权利要求1所述的河豚毒素高纯单体规模化制备方法，其特征在于规模化提取制备河豚毒素的工艺用于河豚毒素其它衍生物的提取制备。
全文摘要
涉及海洋生物毒素的多级膜分离提取制备工艺,尤其涉及一种主要以河豚鱼卵巢或/和肝脏为原料进行规模化提取制备河豚毒素高纯单体的方法,采用微滤,超滤,纳滤和反渗透等多种前沿膜分离技术高效组合协同作用,进行河豚毒素的规模化提取制备并得到河豚毒素结晶。具有高效可靠的优点,可批量获得纯度优于99%的河豚毒素提取物。制得的河豚毒素是神经中枢钠通道阻滞剂,潜在着独特的药用功能和不凡的药理作用,是具有显著经济效益的高值海洋药物资源。
文档编号C07D491/00GK1385431SQ0212146
公开日2002年12月18日 申请日期2002年6月24日 优先权日2002年6月24日
发明者易瑞灶, 许晨, 洪专, 杨志文, 张扬扬 申请人:厦门一元生物工程有限公司