一组产河豚毒素的海洋细菌组合的制作方法
【专利摘要】本发明提供一组产河豚毒素的海洋细菌组合。该组细菌经筛选和细胞工程及生物技术改造以后，具有稳定产生河豚毒素的功能，可以达到工业化生产河豚毒素的目的。本发明涉及到一组海洋微生物的选择，这些微生物可能具有生产河豚毒素的特征；也涉及通过人工选育和生物技术的方法，使得所选用的菌种能够持续保持稳定的遗传特征和持续生产毒素的能力；还涉及到一种经过改进的培养上述微生物组的合理有效的方法和条件。
【专利说明】一组产河豚毒素的海洋细菌组合
【技术领域】
[0001]本发明创造涉及海洋生物【技术领域】，主要涉及由微生物发酵生产河豚毒素原料，特别是一组产河豚毒素海洋细菌筛选和育种方法。
【背景技术】
[0002]河豚毒素是存在于产河豚毒素鱼类(俗称河豚鱼)及其他生物体内(如一些藻类或微生物)的一种生物碱类天然毒素。河豚毒素是属于毒性最强的一类天然毒素，其毒性比氰化钠还强1000倍。河豚毒素是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。
[0003]中国是全世界河豚鱼产量最多的国家，现初步查明的全球54种中，中国有35种，大部分为东方飩属，分布在东海、黄海、渤海等水域。年产量约在3-4万吨，占世界河豚鱼总产量的70%左右。随着几种主要东方飩品种的人工繁殖与苗种培育的成功，加速推进了中国河豚鱼人工养殖的发展。
[0004]河豚毒素的英文名称:Tetrodotoxin,缩写作TTX。分子式C11H17N308,分子量319.27。化学名称:八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基_5，9，7，10a-二甲基-10aH-[l，3] 二氧桥[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-五醇。见说明书附图1。
[0005]河豚毒素主要用于镇痛和戒毒，也可以用于治疗外伤性疼痛、神经性疼痛、癌症疼痛、术后疼痛，还有治疗皮肤病如湿疹、癣、疥等，还有去腐生新的作用如烧伤、烫伤、疖、痈等的治疗，在壮阳及治疗女性性冷淡方面也有良好的疗效，也有关于治疗高血压等相关的报道。河豚毒素的主要特点就是它不具备成瘾性，因此得到广泛用途。
[0006]河豚毒素的生产目前有三种途径，一种就是传统意义上的从河豚鱼内脏提取分离的办法，该方法步骤繁琐、得率低、产品纯度有限，而且大量消耗河豚资源，对生态环境造成破坏。第二种途径是用化学方法人工合成，但步骤冗长、难度大，目前尚无实际应用价值。第三种途径就是通过微生物发酵的方法获得河豚毒素，但是这种方法的局限是产品水平低下、菌种遗传特征不稳定，因此基本处于实验室研究阶段。以上这些因素严重制约河豚毒素的产量。
[0007]由于河豚毒素有广泛的用途，但其产量有限，因此该产品在市场上供不应求、价格高昂。许多企业和研究机构都投入大量人力物力，企图找到解决这一难题的途径。到目前为止，效果并不明显。
[0008]我们经过十数年的努力，在菌种选育、复壮、发酵选育、细胞工程改造、生物技术改造等方面工作的基础上，筛选出一组海洋微生物菌种，该组微生物保持了稳定的遗传特征和稳定的河豚毒素产率；微生物能产生具有较高含量的河豚毒素，且所获菌株传代10代以上，遗传性状稳定。
[0009]同时，也对该组微生物的培育条件进行了优化，从而使得微生物的生长条件和产生河豚毒素的条件更加稳定，这些都为河豚毒素的产业化奠定了生物学基础。
【发明内容】
[0010]本发明创造要解决的问题是提供从海洋微生物中通过相关的手段筛选出一组协同生产河豚毒素的海洋细菌，该组海洋细菌具有遗传特征稳定，产毒素含量较高的特点。解决现有技术中的至少部分难题，以及提供改进的方法。本发明的方法将提供高产量的TTX，因而克服了使用有限的河豚鱼资源的难题，同时容许微生物持续保持生产毒素的特征。
[0011]为解决上述技术问题，本发明创造采用的技术方案是:本发明涉及到一组海洋微生物的选择，这些微生物可能具有生产河豚毒素的特征。
[0012]本发明也涉及通过人工选育和生物技术的方法，使得所选用的菌种能够持续保持稳定的遗传特征和持续生产毒素的能力。
[0013]本发明还涉及到一种经过改进的培养上述微生物组的合理有效的方法和条件。
[0014]在本发明的第一个方面中，提供了获得由细菌菌株产生的河豚毒素的可持续的方法，所述细菌菌株能够在培养介质中产生所述毒素，包括:
[0015]a)从许多海洋动物内脏或血液以及海洋植物表面中分离提取海洋微生物；
[0016]b)所述海洋动物包括但不限于章鱼、天使鱼、鳕鱼、翻车鱼、飩科鱼、海星、螃蟹、蜗牛、扁形虫、软体动物等；
[0017]c)所述海洋植物涵盖海洋绿藻、褐藻、红藻等多种藻类；
[0018]d)所述的海洋细菌主要是海洋弧菌，包括但不限于溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)、海洋弧菌(Vibr1 sp)、地中海弧菌(Vibr1mediterranei)、哈维氏弧菌(Vibr1 harveyi),、塔氏弧菌(Vibr1 tubiashii)、肠炎弧菌(Vibr1parahaemolyticus)、坎普氏弧菌(Vibr1 campbelli)、飘浮弧菌(Vibr1 natriegens)、费氏弧菌(Vibr1 fischeri)、创伤弧菌(Vibr1 vulnificus)、灿烂弧菌(Vibr1splendidus)、东方弧菌(Vibr1 orientalis)、海弧菌(Vibr1 pelagius)、鲑弧菌(Vibr1wodanis)、弗氏弧菌(Vibr1 furnissii)、鱼肠道弧菌(Vibr1 ichthyoenteri)、杀扇贝弧菌(Vibr1pectenicida)、火神弧菌(Vibr1 logei)、拟态弧菌(Vibr1 mimicus)、贻贝弧菌(Vibr1mytili)、留萌弧菌(Vibr1 rumoiensis)、獲弧菌(Vibr1 anguillarum)、产气弧菌(Vibr1 gaxogenes)、鲍鱼肠弧菌(Vibr1 hal1ticoli)、霍氏弧菌(Vibr1hollisae)、奥氏弧菌(Vibr10rdalii)、梅氏弧菌(Vibr1 metschnk1vi)或未被描述的弧菌。
[0019]e)所述的海洋细菌也包括海洋芽孢杆菌，包括但不限于梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiforms) WS301、WS551、WS209、WS919、875、WS231、WS515、614、317、WS443，海洋芽孢杆菌(Bacillus spp.) WS501、WS601、WS062、WS060、WS063、WS121、WS302、WS431、WS601、WS124、WS151、WS203、WS555和WS204，或者未被描述的芽孢杆菌。
[0020]f)细菌群体筛选所需要的菌株，使所述细菌菌株组在发酵培养物中生长。
[0021]在本发明的第二个方面中，提供了所述海洋细菌的筛选方法，这些方法包括在菌种选育、复壮、发酵选育、细胞工程改造、生物技术改造等方面工作，比如:
[0022]a);采用微生物常用的菌种选育方法，对第一方面d)和e)中所述的微生物进行筛选，包括但不限于控制培养条件、形态特征的观察、培养特征观察、营养要求、生理生化指标、发酵周期、所耐受的最高温度、最适合的生长温度、酸碱度等；
[0023]b);对筛选出来的菌种进行发酵选育和复壮处理，包括但不限于菌种活化、初级和次级筛选、生长曲线的制定、毒素活性的检测等；
[0024]c)所述的海洋微生物进行细胞工程即生物工程的必要的改造，内容包括但不限于细胞诱变、细胞培育、细胞融合、DNA和RNA整合及改良等。
[0025]在本发明的第三个方面中，提供了所述海洋细菌的培养方法，这些方法包括营养成分的选择、培养温度的选择、培养酸碱度的选择、培养条件的选择等方面工作，比如:
[0026]a);所述的营养成分的选择包括糖分、蛋白质、磷酸、碳源、无机盐成分等；以重量百分百计，蔗糖0.3-1.0%，酵母膏0.1-0.6%，蛋白胨0.3-0.7%，磷酸氢二钾0.5-0.8% ；
[0027]b);所述的合适的发酵培养温度为摄氏15至35度；最佳培养周期为24至96小时；
[0028]c);所述的合适的发酵培养酸碱度为pH4.0至pH7.5。
[0029]在一个实施方式中，所述细菌菌株是弧菌属的菌株。
[0030]在一个实施方式中，所述细菌菌株是芽孢杆菌的菌株。
[0031]在一个实施方式中，所述海洋细菌菌株是弧菌和芽孢杆菌的组合。
[0032]在一个实施方式中，所述发酵培养基是用于培养弧菌的标准培养基。
[0033]在一个实施方式中，所述发酵培养基是用于培养芽孢杆菌的标准培养基。
[0034]在一个实施方式中，所述发酵培养基是用于培养细菌组合的培养基。
[0035]在一个实施方式中，所述细菌菌株包含经过筛选和改造的河豚毒素生产细菌。
[0036]本发明创造具有的优点和积极效果是:涉及到一组海洋微生物的选择，这些微生物可能具有生产河豚毒素的特征；也涉及通过人工选育和生物技术的方法，使得所选用的菌种能够持续保持稳定的遗传特征和持续生产毒素的能力；还涉及到一种经过改进的培养上述微生物组的合理有效的方法和条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是河豚毒素的分子式示意图
【具体实施方式】
[0038]实施例1:
[0039]海洋弧菌产河豚毒素菌株的培养。
[0040]使用改良的2216E。121 V 20min,酵母膏0.3_lg，蛋白胨0.5-10g,牛肉膏0.1-2.0g, FeP040.0lg,过滤海水1L，ρΗ7.4?7.6。平板培养基加琼脂粉1go培养温度为15-35摄氏温度。菌株经过36-72小时活化后，接种于液体培养液中，振摇培养作为种子液，然后接种到发酵罐中，通气培养48-96小时。培养液经过提取和分离处理后，进入提纯和结晶程序。
[0041]实施例2:
[0042]海洋芽孢杆菌产河豚毒素菌株的培养
[0043]斜面保存培养基是改良的淀粉培养基，活化菌种用培养基为改良的伊莫培养基，发酵培养基和种子培养基相同，蔗糖或葡萄糖0.05-3.55%，酵母膏0.06-0.9%，蛋白胨
0.05-0.99%，磷酸二氢钾0.05-0.5%。培养温度为15-35摄氏温度。菌株经过36-72小时活化后，接种于液体培养液中，振摇培养作为种子液，然后接种到发酵罐中，通气培养48-96小时。培养液经过提取和分离处理后，进入提纯和结晶程序。
[0044]实施例3:
[0045]生产河豚毒素海洋细菌组合培养基的研究
[0046]使用改良的2216E培养基。121°C 20min，酵母膏0.05_lg，蛋白胨00.5_10g，牛肉# 0.1-2.0g, FeP04 0.0lg，过滤海水 1L，磷酸二氢钾 0.05-0.5%。ρΗ6.8 ?7.6。平板培养基加琼脂粉1g和适量淀粉糊。
[0047]实施例4:
[0048]生产河豚毒素海洋细菌组合菌株的培养
[0049]将培养的弧菌和芽孢杆菌按1:2的比例混合后，经离心后，加入改良的培养液进行培养。培养温度为15-35摄氏温度。菌株经过36-72小时活化后,接种于液体培养液中，振摇培养作为种子液，然后接种到发酵罐中，通气培养48-96小时。培养液经过提取和分离处理后，进入提纯和结晶程序。
[0050]实施例5:
[0051]海洋细菌组合产河豚毒素的分离、提取、纯化及结晶。
[0052]发酵的菌液离心保存上清液，沉淀的细胞用弱酸溶液分解后，超声处理后煮沸，冷却后加有机溶剂萃取。合并上清液并超滤浓缩。浓缩液经过离子交换树脂和柱层析的的进一步纯化和结晶处理，得到预期的产品。
[0053]以上对本发明创造的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明创造的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明创造范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
【权利要求】
1.一组海洋产河豚毒素细菌组合，其特征在于:该组细菌经筛选和细胞工程及生物技术改造以后，具有稳定产生河豚毒素的功能，可以达到工业化生产河豚毒素的目的。
2.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:该组细菌包括从海洋动物分离筛选得到的一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)WS063和一种弧菌(Vibro sp.)WS386。
3.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:筛选手段包括前期诱变育种和发酵选育。
4.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:细胞工程的改造涉及细胞培养，细胞融合及细胞拆合等手段。
5.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:生物技术的改造涉及基因工程，分子生物学及遗传学等方法。
6.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:对该组细菌的培养条件进行了整合。
7.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:发酵培养条件在于:以重量百分百计，蔗糖0.3-1.0%，酵母膏0.1-0.6%，蛋白胨0.3-0.7%，磷酸氢二钾0.5-0.8%。
8.根据权利要求1所述的一组海洋细菌组合，其特征在于:其培养温度在18-30摄氏度。
【文档编号】C12N1/20GK104328070SQ201410570683
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】仵小南 申请人:天津瑞麟祥生物科技有限责任公司