N－型钙通道阻断剂的制作方法

专利名称：N－型钙通道阻断剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于新颖的化合物与调节钙通道活性和治疗钙通道功能相关疾病的方法。更具体地说，本发明涉及包含取代或未取代的3-氨基吡咯烷衍生部分的化合物。
背景技术：
通过电压门控钙通道进入细胞的钙介导各种细胞和生理应答，包括兴奋-收缩偶联、激素分泌和基因表达(Miller，R.J.，Science，(1987)，23546-52；Augustine，G.J.等，Annu Rev Neurosci，(1987)，10633-693)。在神经元中，钙通道直接影响膜电位并导致，例如兴奋性、重复发放模式(repetitive firing pattern)和起搏活性等的电特性。钙进入(细胞)还通过直接调节钙依赖型离子通道和钙依赖型酶，例如蛋白激酶C和调钙蛋白依赖型蛋白激酶II的活性来影响神经元功能。突触神经末稍中钙浓度的增加可激发神经递质释放和钙通道开放，而钙通道也影响发育神经元的轴突长出和生长锥(growth cone)迁移。
钙通道介导各种常规生理功能，也涉及许多人类疾病。钙介导的人类疾病的例子包括但不限于先天性偏头痛、小脑共济失调、心绞痛、癫痫、高血压、局部缺血和某些心率失常。治疗性钙通道拮抗剂(例如，二氢吡啶、苯基烷基胺和苯并硫氮杂类(benzothiazepine)均靶向L-型钙通道)(Janis，R.J和Triggle，D.J.，《钙通道其特性、功能、调节和临床相关性》(Calcium ChannelsTheir Properties，Functions，Regulation and Clinical Relevance)，(1991)，CRC Press，伦敦)的开发有助于这些疾病的临床治疗。
天然钙通道根据其电生理和药理学特性分为T-、L-、N-、P/Q-和R-型(综述于Catterall，W.，Annu Rev Cell Dev Biol，(2000)，16521-55；Huguenard，J.R.，Annu Rev Physiol，(1996)，58329-348)。T-型(或低电压激活的)通道描述了多类能在负电位瞬时活化且对静息电位变化高度敏感的分子。
L-、N-和P/Q-型通道在更高的正电位(高电压激活的)激活并显示不同的动力学性质和电压依赖型特性(Catterall，W.，同上；Huguenard，J.R.，同上)。L-型通道因其敏感性而与几类治疗上有用的有机小分子，包括二氢吡啶(DHP)、苯基烷基胺和苯并硫氮杂类相区别。相反，N-型和P/Q-型通道对某些由毒蜘蛛和海蜗牛产生的肽毒素具有高亲和力。N-型通道可被分离自地纹芋螺(Conus geographus)的ω-芋螺肽ω-芋螺毒素GVIA(ω-CTx-GVIA)和分离自幻芋螺(Conus magus)的ω-芋螺毒素MVIIA(ω-CTx-MVIIA)阻断。另一方面，P/Q-型通道对ω-CTx-MVIIA有抗性而对漏斗网蜘蛛(funnel web spider)肽、ω-美洲蜘蛛毒素IVA(ω-Aga-IVA)敏感。R-型钙通道对狼蛛毒素，SNX-482的阻断敏感。
神经元高电压激活的钙通道由以下亚单位组成已鉴定为药物制剂靶子的大的(＞200kDa)孔形成α1亚单位、紧密结合α1亚单位并调节通道生物物理特性的位于胞浆内的约50-70kDaβ亚单位和约170kDa的α2δ亚单位组成(其综述见Stea等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1994)，9110576-10580；Catterall，W.，同上)。已在分子水平鉴定到了在神经系统中表达的9种不同α1亚单位基因，这些基因显示编码所有主要类型的天然钙流(current)(表1)。
表1神经元钙通道的分类

钙通道显示介导神经病理性疼痛相关的神经元致敏过程的发生和维持，并提供镇痛药开发的有吸引力的靶点(其综述见于Vanegas，H.和Schaible，H-G.，Pain，(2000)，859-18)。所有的高阈值Ca通道类型表达于脊髓中，目前正在研究L-、N和P/Q-型在急性痛觉感受中的作用。相反，对这些通道在更多慢性疼痛疾病中的功能作用的研究强烈表明了N-型通道的病理生理作用(其综述见Vanegas，H.和Schaible，H-G.，同上)。
动物的钙通道α1亚单位基因的突变可提供用于干预疼痛的潜在治疗靶点的重要线索。几个独立的研究小组报道了α1BN型钙通道基因经遗传学方法改变的裸小鼠(Ino，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(2001)，985323-5328；Kim，C.等，Mol Cell Neurosci，(2001)，18235-245；Kim，D.等，Neuron，(2001)，3135-45；Saegusa，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(2000)，976132-6137；Hatakeyama，S.等，NeuroReport，(2001)，122423-2427)。α1BN型裸小鼠可存活、可繁殖并显示出正常的运动协调性。在一项研究中，N型基因敲除的小鼠的外周体温、血压和心率正常(Saegusa，H等，同上)。在另一项研究中，两侧颈动脉闭塞后，交感神经系统介导的压力感受器反射降低(Ino，M等，同上)。另一项研究检查了小鼠的其它行为变化并发现小鼠除了表现出明显的焦虑相关行为较低外其它均正常(Saegusa，H等，同上)，这些结果表明N型通道可能是情感障碍以及疼痛的潜在靶点。在所有的研究中，缺乏功能性N型通道的小鼠的慢性和炎性疼痛反应显著降低。相反，缺乏功能性N型通道的小鼠一般表现出正常的急性疼痛反应。
FDA批准或研究的作用于N型通道的药物的两个例子是加巴喷丁和齐考诺肽(ziconotide)。加巴喷丁(1-(氨基甲基)环己烷乙酸(Neurontin))是最初在许多动物癫痫模型(Taylor，C.P.等，Epilepsy Res，(1998)，29233-249)中发现具有活性的一种抗惊厥药。后续的工作证实加巴喷丁在许多不同的动物疼痛模型中成功预防了痛觉过敏，所述动物疼痛模型包括慢性阻塞性损伤(CCI)、热痛觉过敏(heathyperalgesia)、炎症、糖尿病神经病变、手术后疼痛相关的静态和动态机械性异常疼痛(Taylor，C.P.等，同上；Cesena，R.M.和Calcutt，N.A.，Neurosci Lett，(1999)，262101-104；Field，M.J.等，Pain，(1999)，80391-398；Cheng，J-K.等，Anesthesiology，(2000)，921126-1131；Nicholson，B.，Acta Neurol Scand，(2000)，101359-371)。
尽管其作用机理尚未完全了解，目前的证据表明加巴喷丁不直接与许多神经系统中的GABA受体相互作用，而是调节高阈值钙通道的活性。加巴喷丁已显示与钙通道α2δ辅助亚单位结合，然而这种相互作用是否可解释其在神经病理性疼痛中的治疗作用还有待确定。
加巴喷丁在人体中表现出抵御各种神经性疼痛疾病的临床有效的抗痛觉过敏活性。许多开放标记病例研究和3个大型双盲试验表明加巴喷丁可用于治疗疼痛。在治疗以下疾病的研究中采用了300-24000mg/天的剂量糖尿病神经病变(Backonja，M.等，JAMA，(1998)，2801831-1836)、疱疹后神经痛(Rowbotham，M.等，JAMA，(1998)，2801837-1842)、三叉神经痛、癌症和多发性硬化症相关的偏头痛和疼痛(Di Trapani，G.等，Clin Ter，(2000)，151145-148；Caraceni，A.等，J Pain & Symp Manag，(1999)，17441-445；Houtchens，M.K.，MultipleSclerosis，(1997)，3250-253；也参见Magnus，L.，Epilepsia，(1999)，40S66-S72；Laird，M.A.和Gidal，B.E.，Annal Pharmacotherap，(2000)，34802-807；Nicholson，B等，同上)。
齐考诺肽(Prialt；SNX111)是衍生自海蜗牛肽幻芋螺(Conus magus)MVIIA，显示能可逆阻断N型钙通道的一种合成镇痛药。在各种动物模型中，通过鞘内给予的齐考诺肽的选择性阻断明显降低福尔马林2期反应、热痛觉过敏、机械性异常疼痛和术后疼痛(Malmberg，A.B.和Yaksh，T.L.，J Neurosci，(1994)，144882-4890；Bowersox，S.S.，J Pharmacol Exp Ther，(1996)，2791243-1249；Sluka，K.A.，J Pharmacol Exp Ther，(1998)，287232-237；Wang，Y-X.等，Soc Neurosci Abstr，(1998)，241626)。
已在许多临床试验中评价了鞘内给予齐考诺肽来治疗各种疾病，包括疱疹后神经痛、幻肢综合征、HIV相关神经性疼痛和难以治疗的癌症疼痛的效果(综述见Mathur，V.S.，Seminars in Anesthesia，Perioperative medicine and Pain，(2000)，1967-75)。在对鞘内给予鸦片无反应的患者II期和III期临床试验中，齐考诺肽明显降低了疼痛评分并且在许多具体病例中缓解了持续多年的疼痛。也检查了齐考诺肽治疗严重的手术后疼痛以及中风和严重的头部创伤后脑损伤的效果(Heading，C.，Curr Opin CPNS Investigational Drugs，(1999)，1153-166)。在两个病例研究中，还检查了齐考诺肽对于对巴氯芬和吗啡无反应的脊髓受损患者的难以治疗的痉挛的作用(Ridgeway，B.等，Pain，(2000)，85287-289)。在一个病例中，齐考诺肽将痉挛从严重降到中等范围再降至没有并且几乎无副作用。在另一患者中，虽然所需剂量的齐考诺肽将痉挛降至中等范围，但也带来明显的副作用，例如记忆力损失、意识混乱和阻止继续治疗的镇静(作用)。
T型钙通道涉及各种医学疾病。在缺乏表达α1G亚单位基因的小鼠中观察到对缺失癫痫发作具有耐受性(Kim等，同上)。其它研究也涉及α1H亚单位在癫痫发生中的作用(Su H.等，J Neurosci，(2002)，223645-3655)。有很强的证据表明，现有的一些抗惊厥药，例如乙琥胺通过阻断T型通道起作用(Gomora，J.C.等，MolPharmacol，(2001)，601121-1132)。
低压激活的钙通道在心血管系统的组织中高度表达。对T型通道的选择性高于L型10-30倍的钙通道阻断剂-米贝拉地尔(Mibefradil)批准用于治疗高血压和心绞痛。由于它与其它药物的相互作用，投入市场后不久即撤出了(Heady等，2001)。越来越多的例子证明T型钙通道也涉及疼痛。米贝拉地尔和乙琥胺在大鼠的神经病理性疼痛的脊柱神经结扎模型中显示抗痛觉过敏活性(Dogrul等，2003)。
美国专利号5,646,149公开了式A-Y-B所示的钙通道拮抗剂，其中B含有直接与Y相连的哌嗪或哌啶环。必须为抗氧化剂的A代表这些分子的主要成分，据说哌嗪或哌啶自身是重要的。基于已知的钙通道阻断剂，示范性化合物含有二苯甲基取代基。美国专利号5,703,071公开了据说用于治疗局部缺血疾病的化合物。该分子的必须部分是具有取代基的托酚酮残基，例如哌嗪衍生物，包括其二苯甲基衍生物。美国专利号5,428,038公开了据称表现出神经保护性和抗过敏作用的化合物。这些化合物是包含哌嗪和其它六元杂环衍生物的香豆素衍生物。杂环上允许的取代基是二苯基羟甲基。因此，本领域中可能涉及阻断钙通道活性的用于各种适应症的方法利用偶尔含有被二苯甲基取代的哌啶或哌嗪部分但必须有其它取代基以维持功能的化合物。
已知某些含有二苯甲基部分和哌啶或哌嗪的化合物是钙通道阻断剂和神经抑制药物。例如，Gould，R.J.等，Proc Natl Acad Sci，USA，(1983)，805122-5125描述了抗精神分裂症神经抑制药，例如利多氟嗪、氟司必林、匹莫齐特、氯哌莫齐和五氟利多。已证明氟司必林能与L-型钙通道的某些部位结合(King，V.K.等，J BiolChem，(1989)，2645633-5641)并阻断N-型钙流(Grantham，C.J.等，Brit J Pharmacol，(1944)，111483-488)。此外，Kanebo，K.K.开发的洛美利嗪(Lomerizine)是一种已知的钙通道阻断剂。然而，洛美利嗪对N-型通道非特异。有关洛美利嗪的已发表的综述见Dooley，D.，Current Opinion in CPNS Investigational Drugs，(1999)，1116-125。
美国专利6,011,035；6,294,533；6,310,059和6,387,897公开了基于以下事实而设计的选择性N-型钙通道阻断剂，即哌嗪或哌啶环通过接头(linker)与二苯甲基部分偶联的组合产生有效的钙通道阻断活性。
GB 1,281,188描述了具有镇痛活性的1-取代-3-氨基吡咯烷。这些化合物在R和R2处具有一苯基。
美国专利号4,785,119描述了某些简单的3-氨基吡咯烷化合物的合成方法，所述化合物含有通过长度为1或2个碳原子的亚烷基接头与吡咯烷相连的苯基或联苯基。这些化合物可描述成构建化工、医药和农业上有用的产品，特别是制备某些抗细菌产品的结构单元(building block)。
美国专利号6,468,998描述了具有5，HT2拮抗活性的吡咯烷化合物。一些化合物含有只通过C＝O与3-氨基相连的二苯甲基。
发明概述本发明涉及新颖的化合物和调节钙通道活性与治疗钙通道活性相关疾病的方法。具体地说，本发明涉及3-取代吡咯烷的二苯甲基或部分饱和的二苯甲基衍生物，其具有提高这些化合物的钙通道阻断活性的取代基。本发明也提供使用这些化合物来治疗诸如以下疾病的方法中风、焦虑、膀胱反应过度、炎性肠病、头部创伤、偏头痛、慢性、神经病理性和急性疼痛、癫痫、高血压、心律不齐和其它与钙代谢，包括轴突钙通道介导的功能的相关适应症。例如，选择性N-型钙通道阻断剂特别用于治疗疼痛、中风、焦虑、癫痫、炎性肠病和膀胱反应过度。选择性T-型钙通道阻断剂用于治疗癫痫、心血管疾病和疼痛。N-型和T-型通道的双重阻断剂特别用于治疗癫痫、中风和一些形式的疼痛。
一方面，本发明提供下式所示的化合物
或它们的盐，包括它们所有的立体异构体形式，其中X1是CR3或N；W是L2-A3或X1(A1)(A2)；各L1和L2是C1-C10任选取代的亚烷基或C2-C10任选取代的亚烯基(alkenylene)，其中一个或多个所述的C任选被选自N、O或S的杂原子取代，或用＝O进一步取代，或同时为二者所取代；各A1、A2和A3独立为任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的任选取代的5-、6-或7-元脂族环或芳香环，并任选地稠合到其它环；R1和R2是非干扰性取代基；和R3是H或非干扰性取代基；前提是如果L1少于3个连接原子则R2不能为氢，或者如果R2是氢则L1必须含有C＝O。
一方面，本发明涉及式1和2所示化合物，其中如果X1是CH并且W是L2A3时，L1必须含有至少3个连接原子和/或C＝O。在另一方面，本发明涉式1和2所示化合物，其中如果X1是CH和W是L2时，L1必须含有至少3个连接原子，其中苯基是被任选取代的并且其中L2含有两个连接原子。
在上式1和2中，R1和R2是非干扰性取代基。R3可以是氢或非干扰性取代基。一方面，上式1和2中所示的取代基是氢。非干扰性取代基包括但不限于任选取代的烷基(1-10C)、烯基(2-10C)、炔基(2-10C)、芳基(5-12元环)、芳基烷基(7-16C)或芳基烯基(7-16C)，其中各取代基任选含有一个或多个C，通常是1-4C或为杂原子(N、O和/或S)所取代。
此外，各任选的取代基(例如，烷基、烯基等)可包括一个或多个＝O。例如，这些取代基可与和它们相连的原子形成酰基、酰胺或酯键。这些取代基包括但不限于一个或多个卤素、CF3、CN、OCF、NO2、NO、SO、SO2、NR2、OR、SR、COOR和/或CONR2，其中R是H或上述任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基或芳基烯基。这种取代基中硫原子可以是氧化的。此外，两个取代基可形成3-7元饱和或不饱和的环，其中所述环是任选取代的并任选含有一个或多个杂原子(N、S、O)。非干扰性取代基的例子包括但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳基烷基、酰基、＝O、卤素、OR、NR2、SR、-SOR、-SO2R、-OCOR、-NRCOR、-NRCONR2、-NRCOOR、-OCONR2、-RCO、-COOR、SO2R、NRSOR、NRSO2R、-SO3R、-CONR2、SO2NR2，其中各个R独立为H、烷基(1-8C)、CN、CF3和NO2等。
在上式1和2中，R1可以是C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，各个取代基可以是任选取代的并任选含有一个或多个选自O、N和S的杂原子。R1也可以是无机取代基。或者，两个R1可形成＝O或＝NOH，n是0-3。R1也可以是卤素、NO2、SO2、SO、NO、＝O、＝NOH或COOR，其中R是H或C1-C6烷基。
在上式1和2中，R2可以是H、低级烷基或低级烯基。在一个实施例中，R2是H或甲基。
在上式1和2中，接头L1-L2是任选含有一个或多个选自N、O和S的杂原子的亚烷基或亚烯基部分并且任选含有非干扰性取代基。接头中链的成员数可以是1-10。例如，L1可以是C1-C8亚烷基或C1-C8亚烯基并且任选为＝O所取代。在一个实施例中，＝O取代基与式1的NR2毗连，或与式2中吡咯烷基环上的氮原子毗连。
在上式1和2中，各个A1、A2和A3独立为任选取代的苯基、环己基、2-、3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、哒嗪基、苯并三唑基或苯并咪唑基。在一个实施例中，各个A1和A2被卤素、烷氧基或烷基取代。在另一实施例中，各个A1、A2和A3独立为苯基、环己基、吡啶基或嘧啶基。在还有另一实施例中，各个A1、A2和A3是任选被卤素取代的苯基。
在上式1和2中，W是L2-A3，A3是苯基、环己基、2-、3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、哒嗪基、苯并三唑基或苯并咪唑基，各自任选地被一个或多个取代基取代。在另一实施例中，A3是任选被卤素、烷氧基或烷基取代的苯基或吡啶基。
在另一方面，本发明涉及选自以下的化合物(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-N-甲基-苯甲酰胺；
(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(R)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-4-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-3-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-4-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-3-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-2-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-4-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(S)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-N-甲基-乙酰胺；(S)-2-[(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-甲基-氨基]-N，N-二苯基-乙酰胺；(S)-3-二苯甲基-1-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-1-甲基-脲；(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-3-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-吡咯烷-3-基}-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苄基)-甲基-胺；(R)-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-吡咯烷-3-基]-甲基-胺；(S)-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-吡咯烷-3-基}-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-甲基-胺；(S)-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-吡咯烷-3-基]-甲基-胺；(R)-N-{1-[(4-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(4-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[(3-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(3-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[(2-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(2-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-4-叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(4-叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-4-叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(4-叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-3-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；
(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-2-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸乙酯；4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸；1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯；1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸；N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-3，3-二苯基-丙酰胺；1-二苯甲基-3-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-脲；N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-乙酰胺；和2-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基氨基)-N，N-二苯基-乙酰胺。
在另一方面，本发明涉及含有式1和2所示化合物与药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的化合物也可以是适当的盐形式或药物前体形式。
在具体的实施例中，式1和2所示化合物含有至少一个手性中心。这些化合物可以是单独的立体异构体或各种立体异构体的混合物，包括对映异构体混合物、所有可能的立体异构体的等摩尔混合物或各种手性或光学纯度(的混合物)。
本发明也涉及利用式1和2所示化合物拮抗钙通道活性从而治疗钙通道活性相关疾病的方法。例如，式1和2所示化合物可用于治疗不良的钙通道活性相关的疾病。或者，式1和2所示化合物可用于治疗具有正常钙通道活性但却导致不良的身体或代谢状况的对象。
本发明一方面涉及调节对象的钙通道活性的方法，包括给予需要这种治疗的对象式1和2所示化合物或它们的药物组合物。本发明在另一方面涉及缓解对象疼痛的方法，包括给予需要这种治疗的对象权利要求1所述的化合物或其药物组合物。
此外，本发明涉及含有式1和2所示化合物的组合库。本发明也涉及在这种库中筛选具有特别有效的钙通道阻断活性或特异性拮抗一种类型的这些通道的化合物的方法。
附图简述

图1显示了本发明的示范性化合物的名称和结构。
图2显示了化合物P1对N-、P/Q-和L-型通道的选择性。
图3显示了化合物P2对N-、P/Q-和L-型通道的选择性。
图4显示了化合物P4对N-、P/Q-和L-型通道的选择性。
图5显示了化合物P5对N-、P/Q-和L-型通道的选择性。
实施本发明的方式式1和2所示化合物通过它们拮抗钙通道活性的能力显示治疗所需的作用。因此，这些化合物可用于调节钙通道活性以及治疗某些疾病。例如，式1和2所示化合物可用于治疗钙通道介导的病症，例如中风、焦虑、癫痫、头部创伤、偏头痛、慢性、神经病理性和急性疼痛、炎性肠病和膀胱反应过度。钙流(Calcium flux)也涉及其它神经疾病，例如精神分裂症、抑郁症、药物和酒精成瘾与戒除、其它精神病和某些退变性疾病。可用T-型钙通道阻断剂治疗的其它疾病包括心血管疾病，例如高血压和心律不齐。此外，T-型钙通道涉及某些类型的癌症、糖尿病、不育症和性功能障碍。
尽管式1和2所示化合物一般具有该活性，但有多种钙通道阻断剂可用使得对具体的疾病需要精细地选择。因此，该类化合物的可用性不仅可通用于受钙通道活性影响的适应症，也提供了大量可用于和钙通道的具体形式特异性相互作用的化合物。可用重组产生的上述α1A-α1I和α1S型钙通道来协助该选择过程。Dubel，S.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1992)，895058-5062；Fujita，Y.等，Neuron，(1993)，10585-598；Mikami，A.等，Nature，(1989)，340230-233；Mori，Y.等，Nature，(1991)，350398-402；Snutch，T.P.等，Neuron，(1991)，745-57；Soong，T.W.等，Science，(1993)，2601133-1136；Tomlinson，W.J.等，Neuropharmacology，(1993)，321117-1126；Williams，M.E.，Science，(1992)，257389-395；Williams，M.E.，Neuron，(1992)，871-84；Perez-Reyes，E.等，Nature，(1998)，391896-900；Cribbs，L.L.等，Circulation Research，(1998，83103-109)；Lee，J.H.等，Neuroscience，(1999)，191912-1921；McRory，J.E.等，J Biol Chem，(2001)，2763999-4011。
钙通道的抑制作用有三种不同的类型。第一种称为“开放性通道阻断”，通常指钙通道显示维持在约-100mV的人工负静息电位(与典型的约-70mV的内源性静息维持电位不同)。当显示的通道在这些条件下突然去极化时，引起钙离子流过此通道，显示出峰值电流然后衰减。开放性通道阻断抑制剂降低该峰值电流，并加速电流衰减的速度。
该抑制类型与本文称为“灭活抑制”的第二类阻断不同。当通道维持在较低负静息电位，如生理学上重要的电位-70mV时，通过突然去极化，一定百分比通道的可发生构型变化，使其不能被活化(即打开)。因此，不是因为阻断了开放通道，而是因为一些通道不能打开(即，灭活)，从而使钙离子流引起的峰电流降低。“灭活”型抑制剂能增加处于灭活状态的受体的百分比。
第三类抑制作用称为“静息性通道阻断”。静息性通道阻断是在无膜去极化时发生的通道抑制，通常导致打开或灭活。例如，静息性通道阻断剂能在药物应用后的最初去极化过程中降低峰电流幅度，而对去极化过程没有额外的抑制作用。
除能够调节具体的钙通道外，需要所述化合物对心脏中表达的HERG K+通道具有非常低的活性。高效阻断HERG K+通道的化合物可产生致命副反应。因此，调节钙通道的化合物还不应该抑制HERG K+通道。类似地，由于细胞色素p450酶是药物解毒必需的，不希望所述化合物抑制此酶。最后，通过比较所述化合物在各种类型钙通道中的活性来评价它们对钙离子通道类型的特异性，优选对一种特定通道有特异性。然后，成功通过这些测试的化合物作为实际候选药物在动物模型中检测。
本发明化合物本发明涉及具有下式的化合物
或它们的盐，包括它们所有的立体异构体形式，其中X1是CR3或N；W是L2-A3或X1(A1)(A2)；各个L1和L2是C1-C10任选取代的亚烷基或C2-C10任选取代的亚烯基，其中一个或多个所述的C任选被选自N、O或S的杂原子取代，或用＝O进一步取代，或同时为二者所取代；各个A1、A2和A3独立为任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的任选取代的5-、6-或7-元脂族环或芳香环，并任选稠合到其它环；R1和R2是非干扰性取代基；和R3是H或非干扰性取代基；前提是如果L1少于3个连接原子则R2不能为氢，或者如果R2是氢则L1必须含有C＝O。
一方面，各个A1、A2和A3(全体“A”)独立为任选取代的5-、6-或7-元脂肪族或芳香族环，任选含有一个或多个选自O、N和S的杂原子并任选稠合到其它环。在一个实施例中，A代表的环独立地为任选取代的苯基、环己基、2-、3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、哒嗪基、苯并三唑基或苯并咪唑基。在一个实施例中，A代表的环独立为苯基、环己基、吡啶基或嘧啶基。在一具体的实施例中，A1、A2和A3独立为环己基或苯基。每种这些基团任选地被以下基团取代如任选取代的烷基、烯基、炔基、芳基、O-芳基、O-烷基芳基、O-芳酰基、NR-芳基、N-烷基芳基、NR-芳酰基、卤素、OR、NR2、SR、-OOCR、-NROCR、RCO、-COOR、-CONR2和/或SO2NR2，其中各R独立为H或烷基(1-8C)，和/或为CN、CF3、和/或NO2取代。在一具体的实施方案中，任选取代的烷基、烯基、炔基和芳基取代基任选独立地被上述相似的取代基取代。
A代表的环可任选地被含有15个或15个以下的非氢原子的无机取代基或有机取代基所取代。这些取代基包括任选取代的烷基(1-10C)、任选取代的烯基(2-10C)、任选取代的炔基(2-10C)、其它芳基基团(5-12元环)、芳基烷基、芳基烯基或芳基炔基(其中，芳基、烷基、烯基和炔基如上定义)。此外，这些取代基中的任何一个的一个或多个碳可被选自O、S、和N的杂原子取代。各A也可独立地且任选地被一个或多个选自以下的无机基团取代如卤素、硝基、巯基、羟基、氨基、或OH、SH或NH2，其中H被上述任选取代的有机基团所取代。这些基团依次可进一步取代，例如用＝O取代。A上优选的取代基是叔丁基、甲氧基、取代的烷氧基、羟基和卤素。
在另一方面，W是L2-A3或X1(A1)(A2)，其中A1、A2和A3如以上所述；X1是CR3或N，其中R3是氢或非干扰性取代基；L2是C1-C10任选取代的亚烷基或或C2-C10任选取代的亚烯基，其中一个或多个所述的C任选被选自N、O或S的杂原子取代，或用＝O进一步取代，或同时为二者所取代。在一个实施例中，A代表的环独立为苯基(Φ)，或其部分或完全饱和形式(“Cy”)。W的例子包括但不限于CH2Φ、COΦ、CHΦ2、CH2CH2X3Φ、COCH2X3Φ、CH2Cy、CH2Cy2和CHCyΦ，其中X3是C＝O、NR、NCO、S或O，其中各个Φ或Cy未被取代或被1-3个取代基取代。
所述1-3个取代基独立地选自卤素、CF3、OCF、低级烷基(1-6C)、低级芳基(6-10C)和芳基烷基(7-16C)，各个取代基任选含有1-4个杂原子(N、O或S)并任选被无机取代基(包括卤素、N、P、O或S)取代。无机取代基的例子包括但不限于卤素、NO2、NR2、OR、SR、COR、COOR、CONR2、NROCR、OOCR，其中R＝H或烷基(1-8C)。两个取代基可形成任选含有杂原子(N、S或O)的3-7元环。
在还有另一方面，R1和R2是非干扰性取代基。在一个实施例中，n是0-7，优选0-2，最优选0-1。如果n是2或3，R1优选位于吡咯烷环上不同的位置。R1具有的非干扰性取代基包括但不限于任选含有一个或多个选自O、N和S的杂原子的低级烷基(1-6C)、低级烯基(2-6C)和低级炔基(2-6C)，包括含有，例如卤素、NO2、SO2、SO、NO等无机取代基的这些取代基的取代形式。R1本身可以是这些无机取代基的一种。在一个实施例中，同一碳上的两个R1都可一起(形成)＝O或＝NOH。R2的例子包括但不限于H、低级烷基、低级烯基和卤素，优选H或低级烷基，更优选H或甲基。
在另一方面，L1是隔开X1(A1)(A2)基团与吡咯烷上的环氮原子或吡咯烷的3-氨基取代基的氮原子的接头。L1通常是任选取代的亚烷基或亚烯基。例如，L1可用＝O在与L1相偶联的氮原子毗连的碳原子上进行取代。亚烷基或亚烯基链可以含有1-10个原子，优选1-8个原子，更优选3-6个原子。在另一实施例中，亚烷基或亚烯基链是未取代的或者在毗连N的C处含有＝O的单取代基。也可用杂原子，优选N或O取代该链的一个或多个碳原子。在具体的实施方案中，只有一个杂原子取代了一个碳原子。
在另一方面，L2是如L1所定义的接头，其隔开A3环与吡咯烷上的环氮原子或吡咯烷的3-氨基取代基的氮原子。在一个实施例中，L2短于L1并含有1-4元的亚烷基或亚烯基。在另一实施例中，L2含有可任选取代的一个亚烷基。L2的例子包括但不限于CH2或C＝O。
本文使用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”包括直链、支链或环状一价取代基，当这些取代基未被取代时或除非另有注明，只含有C和H。例子包括甲基、乙基、异丁基、环己基、环戊基乙基、2-丙烯基、3-丁炔基等。烷基、烯基和炔基取代基通常含有1-10C(烷基)或2-10C(烯基或炔基)。它们优选含有1-6C(低级烷基)或2-6C(低级烯基或低级炔基)。
任选取代的烷基的其它例子包括但不限于丙基、叔丁基和环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。任选取代的烯基的例子包括但不限于烯丙基、巴豆基、2-戊烯基、3-己烯基、2-环戊烯基、2-环己烯基、2-环戊烯基甲基、2-环己烯基甲基等。在一个实施方案中，各接头含有C1-6烷基和烯基。
本文使用的术语“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”包括上述定义的直链、支链和状一价取代基并且在骨架残基中含有一个或多个O、S或N杂原子或它们的组合。
本文使用的术语“酰基”包括通过羰基与其它残基偶联的烷基、烯基、炔基。本文使用的术语“杂酰基”包括所述酰基化合物的相关杂原子形式。
本文使用的“芳香族”或“芳基”指单环或稠合的双环基团，例如苯基或萘基。术语“杂芳香族”指含有一个或多个选自O、S和N的杂原子的单环或稠合双环的环系统。该定义包括就电子在整个环系统的分布而言具有芳香特性的任何单环或稠合的双环系统。芳香族和杂芳香族系统的例子包括但不限于吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并三唑基、异喹啉基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、唑基、咪唑基等。由于理论上可能有互变异构体，苯二甲酰亚氨基也认为是芳香族。环系统一般含有5-12个环原子。在具体的实施方案中，芳香族和杂芳香族系统含有5-7个环原子。
术语“芳基烷基”和“杂芳基烷基”类似地指通过碳链偶联于另一残基的芳香族和杂芳香族系统，所述碳链包括取代或未取代的、饱和或不饱和的碳链，通常是1-8C或它们的杂原子形式。这些碳链也可含有羰基，从而使它们能提供诸如酰基或杂酰基的取代基。
总体上，取代基所含的任何烷基、烯基、炔基、酰基或芳基本身可任选被其它取代基取代。这些取代基的性质与其原来的取代基本身的性质相似。例如烷基取代基可任选被另一取代基，包括但不限于烷基、烯基、芳基、氨基、烷氧基等取代。
卤素的例子包括氟、氯、溴、碘，优选氟和氯。
任选取代的羟基和巯基的例子包括任选取代的烷氧基或烷硫基(例如C1-10烷基如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等)。任选取代的羟基和巯基也包括芳基烷氧基或芳基烷硫基(例如苯基-C1-4烷基如苄基、苯乙基等)。在存在两个相邻的羟基或巯基取代基之处，杂原子可通过亚烷基来连接，例如O(CH2)nO和S(CH2)nS(其中n＝1-5)。例子包括亚甲二氧基、亚乙二氧基等。也包括硫-醚基团的氧化物如亚砜和砜。任选取代的羟基的其它例子是任选取代的C2-4烷酰基(如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等)，C1-4烷基磺酰基(如甲磺酰基、乙磺酰基等)和任选取代的芳香族和杂环羰基，包括苯甲酰基、吡啶羰基等。
任选取代的氨基上的取代基可相互结合形成环状氨基(例如5-或6-元环状氨基等，如四氢吡咯、哌嗪、哌啶、吡咯烷、吗啉、硫代吗啉、吡咯、咪唑等)。所述环状氨基可具有取代基，例如卤素(如氟、氯、溴、碘等)、硝基、氰基、羟基、巯基、氨基、羧基、任选卤化的C1-4烷基(例如三氟甲基、甲基、乙基等)、任选卤化的C1-4烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基等)、C2-4烷酰基(例如乙酰基、丙酰基等)、C1-4烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基等)。在具体的实施例中，环状氨基优选被1-3个取代基取代。
氨基也可被以下基团一次或两次取代(形成仲胺或叔胺)，例如任选取代的烷基，包括C1-10烷基(如甲基、乙基丙基等)；任选取代的烯基，如烯丙基、巴豆基、2-戊烯基、3-己烯基等；或任选取代的环烷基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。在具体的实施例中，优选C1-6烷基、烯基和环烷基。氨基也可任选被芳香族或杂环基团，芳烷基(如苯基C1-4烷基)或杂烷基取代。例如氨基可任选被以下基团取代苯基、吡啶、苯甲基(苄基)、苯乙基、吡啶基甲基、吡啶基乙基等。杂环基团可以是含有1-4个杂原子的5或6元环。
氨基可被以下基团取代任选取代的C2-4烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基等)，或C1-4烷基磺酰基(例如甲磺酰基、乙磺酰基等)或羰基或磺酰基取代的芳环或杂环，如上所述。羰基或磺酰基取代的芳环或杂环的例子包括但不限于苯磺酰基、苯甲酰基、吡啶磺酰基或吡啶羰基。
任选取代的羰基或磺酰基的例子包括从以上定义的各种烃基如烷基、烯基和5-或6-元单环芳香族基团(例如苯基、吡啶基等)形成的这种基团的任选取代形式。
本发明化合物可具有可电离基团从而可制备为药学上可接受的盐。这些盐可以是包括无机酸和有机酸的酸加成盐，或者，当本发明化合物是酸性时，可从无机或有机碱制备这些盐。无机碱的例子包括但不限于碱金属氢氧化物(如氢氧化钠、氢氧化钾等)、碱土金属氢氧化物(如钙、镁等)、铝、铵等的氢氧化物。有机碱的例子包括但不限于三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、N，N′-二苄基乙二胺等。无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等。有机酸的例子包括甲酸、草酸、乙酸、酒石酸、甲磺酸、苯磺酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。也包括碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐，以及与酸性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
此外，本发明化合物具有一个或多个手性中心。本发明包括分离的立体异构体形式以及各种手性纯度的立体异构体的混合物。例如，本发明化合物在手性原子处可具有R或S构型或它们的混合物。(参见，Wade，Jr.，OrganicChemistry(1987)，第333-398页，Prentice-Hall，Inc.，Englewood Cliffs，NewJersey)。
本发明化合物的合成本发明化合物可用常规方法合成。示范性的这种方法见方案A、B、C、D、E、F、G和H。
反应方案A
反应方案B
反应方案C
反应方案D
反应方案E
反应方案F
反应方案G
反应方案H 库与筛选本发明的化合物可用本领域已知的方法单个合成，或作为组合库的成员而合成。组合库合成是本领域已知的并描述于例如Wentworth，P.，Jr.和Janda，K.D.，Curr Opinion Biotechnol.，(1998)，9109-115；Salemme，F.R.等，Structure，(1997)，5319-324。该文库包含具有各种取代基和各种不饱和度以及不同链长的化合物。该库的成员可少至10个，但一般有几百至几千个。然后在库中筛选特别有效地针对钙通道某特定亚型(例如N型通道)的化合物。
执行这种筛选功能的方法是本领域熟知的。要靶向的受体一般表达在重组宿主细胞，例如人胚肾细胞的表面。检测待测试的各个库化合物结合该通道的能力，例如可通过化合物取代标记的结合配体的能力来测量。标记的结合配体可以是该通道常规相关的配体或该通道的抗体。更常见的是，拮抗该受体的能力可在存在钙、钡或其它渗透性(permeant)的二价阳离子时测量，并用标准技术测量该化合物干扰所产生信号的能力。
一种方法涉及与该钙通道相互作用的放射标记试剂的结合，然后分析平衡结合测量值，包括但不限于结合速率(on rate)、解离速率(off rate)、Kd值及其它分子的竞争性结合。另一种方法涉及通过电生理试验筛选化合物的作用，在试验中，用微电极刺激(impale)单个细胞并记录应用感兴趣化合物之前和之后通过钙通道的电流。另一种方法，即高通量分光光度试验，利用负载了对胞内钙浓度敏感的荧光染料的细胞系，然后测定化合物的作用，例如通过氯化钾或其它方式改变胞内钙水平的去极化能力。
如上所述，可用更明确的试验来区分作为开放性通道阻断剂的、与之相反通过促进该通道灭活而起作用的或作为静息通道阻断剂的钙流抑制剂。区分这些类型的抑制剂的方法具体见以下实施例。总体上，存在或不存在候选化合物的条件下，通过测定在约-100mV的背景静息电位上强行去极化时的峰电流水平来评价开放性通道阻断剂。成功的开放性通道阻断剂将降低观察到的峰电流并加速该电流衰减。通常通过测定化合物将电压依赖性灭活向更高负电位转移的能力来确定化合物是否为灭活通道阻断剂。这也反映在化合物能在更高的去极化保持电位(如-70mV)和在较高的刺激频率，例如0.2Hz对0.067Hz的条件下降低峰电流的能力上。最后，静息性通道阻断剂能在药物应用后的最初去极化过程中降低峰电流幅度，而对去极化过程没有额外的抑制作用。
用途和给药本发明化合物可配制为用于治疗人和动物对象的药物或兽医学组合物。取决于待治疗的对象、给药方式、所需治疗的类型(例如，阻止、预防、治疗)，这些化合物以符合这些参数的方式配制。这种技术总结于引为参考的《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，最新版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.。通常，式1和2所示化合物可单独使用，或作为混合物使用或与其它药物联用。这些化合物可依给药方式制成合适的组合物以便于递送。
制剂可以适合于全身给药或局部或部分给药的方式制备。全身用制剂包括设计为用于注射(如肌肉内、静脉内、皮下注射)的制剂或制备为用于经皮、经粘膜、或口服给药的制剂。该制剂通常含有稀释剂，以及在一些情况下可含有佐剂、缓冲剂、防腐剂等。这些化合物也可以脂质体组合物或微乳液的形式给予。
就注射而言，制剂可制成常规剂型，如液体溶液或悬液，或适合于在注射前配制成液体溶液或悬液的固体形式或乳剂。合适的赋形剂包括，例如水、盐水、葡萄糖、甘油等。这种组合物还可含有一定量的非毒性辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯等。还设计了各种药物缓释系统。例如，参见美国专利5,624,677。
全身给药也包括相对非侵入性的方法，如用栓剂、透皮贴剂、经粘膜递送和鼻内给药。口服给药也适用于本发明化合物，合适的形式包括本领域已知的糖浆、胶囊、片剂。
就给予动物或人对象而言，本发明化合物的剂量通常为0.1-15mg/kg，优选0.1-1mg/kg。然而，剂量水平在很大程度上依赖于疾病性质、药效、患者的状况、医师的判断以及给药频率和方式。
给出以下制剂和实施例是为使本领域的技术人员更加清楚地明白并实施本发明。不应将它们理解为限制了本发明的范围，它们仅是示范性和代表性的。
实施例1合成(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-酰胺 在氮气气氛中向(R)-(1-苄基吡咯烷-3-基)-甲基-胺(0.4g，2.1mmol)的干燥CH2Cl2(30ml)溶液中加入6，6-双-(4-氟苯基)-己酸(0.63g，2.1mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.8g，4.2mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(30ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析纯化得到0.9g所需产物。
实施例2合成(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺 A.合成(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸甲基-吡咯烷-3-基-酰胺 向6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基酰胺(1.0g，2.1mmol)的CH3OH(50ml)溶液中加入Pd/C 20％(250mg)。得到的浆状物在50psi下氢化24小时。用硅藻土(Celite)滤去催化剂并减压蒸发滤液得到0.78g所需产物。
B.合成终产物在氮气气氛中向(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸甲基-吡咯烷-3-基-酰胺(0.78g，2.02mmol)的干燥CH2Cl2(30ml)溶液中加入3，5-二叔丁基-4-甲氧基苯甲酸(0.53g，2.02mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.77g，4.04mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(30ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析纯化得到1.1g所需产物。
实施例3(R)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺 向溴二苯基甲烷(bromodiphenylmethane)(0.29g，1.18mmol)的丁酮(10ml)溶液中加入N-甲基-3，3-二苯基-N-吡咯烷-3-基-丙酰胺(0.55g，1.78mmol)、K2CO3(0.16g，1.18mmol)和KI(0.19g，1.18mmol)。混合物加热回流18小时，然后过滤并真空除去溶剂。残留物溶解于CH2Cl2(50ml)，用水(10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂，然后使用己烷∶EtOAc(1∶2)经柱层析纯化得到所需产物。
实施例4(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-4-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺 向N-甲基-3，3-二苯基-N-吡咯烷-3-基-丙酰胺(0.45g，1.46mmol)的CH2Cl2(10ml)溶液中加入4-吡啶羧醛(pyridinecarboxaldehyde)(0.14ml，1.46-mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(0.4g，1.89mmol)和ACOH(0.17ml，2.92mmol)。得到的溶液在氮气气氛中于室温搅拌过夜。加入饱和的NaHCO3(4ml)猝灭反应混合物，用EtOAc(3×30ml)萃取产物。MgSO4干燥EtOAc萃取相并减压除去溶剂，然后使用丙酮∶EtOAc(1∶1)经柱层析纯化以很好的产率得到所需产物。
实施例5合成(R)-3-二苯甲基-1-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-1-甲基-脲
在氮气气氛中向(R)-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-胺(0.32g，1.68mmol)的干燥CH2Cl2(5ml)溶液中滴入异氰酸二苯基甲酯(0.32ml，1.68mmol)。得到的混合物于室温搅拌过夜。减压除去溶剂，然后使用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析得到0.65g所需产物。
实施例6合成(R)-3-二苯甲基-1-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-1-甲基-脲 A.合成(R)-3-二苯甲基-1-甲基-1-吡咯烷-3-基-脲 向3-二苯甲基-1-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-1-甲基-脲(0.7g，1.75mmol)的CH3OH(25ml)溶液中加入Pd/C 20％(175mg)。得到的浆状物在50psi下氢化24小时。用硅藻土滤去催化剂并减压蒸发滤液得到0.63g所需产物。
B.合成终产物向溴二苯基甲烷(0.43g，1.75mmol)的丁酮(10ml)溶液中加入3-二苯甲基-1-甲基-1-吡咯烷-3-基-脲(0.65g，2.1mmol)、K2CO3(0.24，1.75mmol)和KI(0.29g，1.75mmol)。混合物加热回流18小时，然后过滤并真空除去溶剂。残留物溶解于CH2Cl2(50ml)，用水(10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂，然后使用己烷∶EtOAc(1∶1)经柱层析纯化得到所需产物。
实施例7合成(R)-N-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-N-甲基-乙酰胺 在氮气气氛中向(R)-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-胺(0.32g，1.68mmol)的干燥CH2Cl2(20ml)溶液中加入二苯基氨基乙酸(0.38g，1.68mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.65g，3.36mmol)和DMAP(催化量)，反应混合物在氮气气氛中于室温搅拌过夜。然后减压浓缩反应(混合物)。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(100ml)。用水(25ml，2×)和10％NaOH(25ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析纯化得到0.68g所需产物。
实施例8合成(R)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-N-甲基-乙酰胺 A.合成(R)-2-二苯基氨基-N-甲基-N-吡咯烷-3-基-乙酰胺
向(R)-N-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-N-甲基-乙酰胺(0.68g，1.7mmol)的CH3OH(30ml)溶液中加入Pd/C 20％(170mg)。得到的浆状物于50psi下氢化24小时。经硅藻土滤去催化剂并减压蒸发滤液得到0.6g所需产物。
B.合成终产物向溴二苯基甲烷(0.3g，1.23mmol)的丁酮(10ml)溶液中加入(R)-2-二苯基氨基-N-甲基-N-吡咯烷-3-基-乙酰胺(0.46g，1.5mmol)、K2CO3(0.17g，1.23mmol)和KI(0.2g，1.23mmol)。混合物加热回流18小时，然后过滤并真空除去溶剂。残留物溶解于CH2Cl2(50ml)，用水(10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂，然后使用己烷∶EtOAc(3∶1)经柱层析得到所需产物。
实施例9合成(R)-2-[(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-氨基]-N，N-二苯基-乙酰胺 在氮气气氛中向(R)-(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-胺(0.32g，1.68mmol)的干燥CH3CN(10ml)溶液中加入2-溴-N，N-二苯基乙酰胺(0.49g，1.68mmol)和NaHCO3(0.28g，3.36mmol)。反应混合物回流过夜。冷却后，蒸发溶剂。用水(5ml)溶解残留物并用CHCl3(3×25ml)萃取。MgSO4干燥有机相并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析纯化得到680mg所需产物。
实施例10合成(R)-2-[(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-甲基-氨基]-N，N-二苯基-乙酰胺
A合成(R)-2-(甲基-吡咯烷-3-基-氨基)-N，N-二苯基-乙酰胺 向(R)-2-[(1-苄基-吡咯烷-3-基)-甲基-氨基]-N，N-二苯基乙酰胺(0.68g，1.70mmol)的CH3OH(30ml)溶液中加入Pd/C 20％(170mg)。得到的浆状物于50psi下氢化24小时。经硅藻土滤去催化剂并减压蒸发滤液得到0.5g所需产物。
B.合成终产物向溴二苯基甲烷(0.33g，1.34mmol)的丁酮(10ml)溶液中加入(R)-2-(甲基-吡咯烷-3-基-氨基)-N，N-二苯基乙酰胺(0.5g，1.61mmol)、K2CO3(0.18g，1.34mmol)和KI(0.22g，1.34mmol)。混合物加热回流18小时，然后过滤并真空除去溶剂。残留物溶解于CH2Cl2(50ml)，用水(10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂，然后使用己烷∶EtOAc(1∶1)经柱层析得到所需产物。
实施例11合成(2S，4S)-4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯 A.合成(2S，4R)-4-羟基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯
向(4R)-(叔丁氧基羰基)-4-羟基-L-脯氨酸(26)(0.92g，4.0mmol)的干燥CH2Cl2(30ml)溶液中加入乙醇(1ml，21mmol)。向反应(体系)中加入DDC(1.64g，8.0mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应(混合物)。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(100ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(10ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶CH3OH(10∶1)经柱层析纯化得到1.8g油状的所需产物。
B.合成(2S，4R)-4-(甲苯-4-磺酰基氧基)-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯 于0℃在氮气气氛中向(2S，4R)-4-羟基-吡咯烷-1，2-是羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(27)(1.8g，7mmol)的干燥吡啶(40ml)溶液中加入对-甲苯磺酰氯(4.0g，21mmol)。反应混合物维持于0℃冷冻2天。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用石油醚(pet ether)∶EtOAc(1∶1)经柱层析纯化得到2.6g所需产物。
C.合成(2S，4S)-4-叠氮基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯
向(2S，4R)-4-(甲苯-4-磺酰基氧基)-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(28)(2.6g，6.3mmol)的干燥DMF(15ml)溶液中加入NaN3(0.41g，6.3mmol)。反应混合物于室温搅拌过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用石油醚∶CH2Cl2∶MeOH(10∶1)经柱层析纯化得到1.8g所需产物。
D.合成(2S，4S)-4-氨基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯 向(2S，4S)-4-叠氮基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(29)(1.8g，2.1mmol)的CH3OH(40ml)溶液中加入Pd/C 10％(50mg)。得到的浆状物于1atm下氢化24小时。用硅藻土滤去催化剂并减压蒸发滤液得到0.95g所需产物。
E.合成(2S，4S)-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯 向(2S，4S)-4-氨基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(30)(0.5g，2mmol)的干燥CH2Cl2(30ml)溶液中加入6，6-双-(4-氟苯基)-己酸(0.62g，2mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.77g，4mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应(混合物)。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(10ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用石油醚∶EtOAc(1∶1)经柱层析纯化得到0.6g所需产物。
F.合成(2S，4S)-4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-吡咯烷-2-羧酸乙酯
向(2S，4S)-4-氨基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(31)(0.6g，1.1mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液中加入CF3CO2H(8ml)。得到的混合物在氮气气氛中搅拌3小时。然后减压浓缩反应混合物。残留物用饱和的碳酸氢钠(溶液)中和并用乙酸乙酯萃取两次。MgSO4干燥有机层并蒸发至干。得到的残留物无需纯化即可用于下一步反应。
G.合成终产物向(2S，4S)-4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-吡咯烷-2-羧酸乙酯(32)(0.39g，0.88mmol)的干燥CH2Cl2(20ml)溶液中加入3，5-二叔丁基-4-甲氧基苯甲酸(0.23g，0.88mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.34g，1.76mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(10ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用石油醚∶EtOAc(1∶1)经柱层析纯化得到0.46g所需产物。
实施例12合成(2S，4S)-4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-2-羧酸 向(2S，4S)-4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯(33)(0.32g，0.52mmol)的THF(15ml)、MeOH(5ml)和水(5ml)溶液中加入LiOH(0.1g，2.45mmol)并于室温搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物用2N HCl中和至pH约2并溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶MeOH(1∶1)经柱层析纯化得到0.26g所需产物。
实施例13合成(2S，4S)-1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯 A.合成(2S，4S)-4-(3，3-二苯基氧基)-吡咯烷-1，2-羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯 向(2S，4S)-4-氨基-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(30)(0.512g，2mmol)的干燥CH2Cl2(20ml)溶液中加入3，3-二苯基-丙酸(0.452g，2mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.76g，4mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)和10％NaOH(10ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶CH3OH(15∶1)经柱层析纯化得到0.78g所需产物。
B.合成(2S，4S)-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯
向(2S，4S)-4-(3，3-二苯基氨基)-吡咯烷-1，2-二羧酸-1-叔丁酯-2-乙酯(35)(0.78g，1.7mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液中加入CF3CO2H(8ml)。得到的混合物于室温搅拌3小时。然后减压浓缩反应混合物。残留物用碳酸钠中和并用乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)萃取两次。用水(30ml，2×)和10％NaOH(10ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物无需进一步纯化即可用于下一步反应。
C.合成终产物向溴二苯基甲烷(0.4g，1.64mmol)的丁酮(10ml)溶液中加入(2S，4S)-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯(36)(0.6g，1.64mmol)、K2CO3(0.23g，1.64mmol)和KI(0.27g，1.64mmol)。混合物加热回流18小时，然后过滤并真空除去溶剂。残留物溶解于CH2Cl2(50ml)，用水(10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂，然后使用己烷∶EtOAc(1∶1)经柱层析得到0.5g所需产物。
实施例14合成(2S，4S)-1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸 向(2S，4S)-1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯(37)(0.25g，0.5mmol)的THF(15ml)、MeOH(5ml)和水(5ml)溶液中加入LiOH(0.1g，2.45mmol)并于室温搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物用2N HCl中和至pH约2并溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(150ml)。用水(30ml，2×)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶MeOH(10∶1)经柱层析纯化得到0.12g所需产物。
实施例15合成N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-3，3-二苯基-丙酰胺 A.合成3-氨基-吡咯烷-2-酮 二氨基丁酸(5g，26.16mmol)、二甲苯(450ml)、六甲基二硅氮烷(40ml，183.12mmol)和少许几滴三甲基氯硅烷加热回流并小心地通氮气流48小时(3-5小时后完全溶解)，然后冷却，倒入无水乙醇(100ml)并在真空中蒸发至干。过滤残留物并用乙醚洗涤，以98％的产率得到所需产物。
B.合成(2-氧代-吡咯烷-3-基)-氨基甲酸叔丁酯 向3-氨基-吡咯烷-2-酮(39)(2.8g，28mmol)的[甲醇∶三乙胺(9∶1)](130ml)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(6.7g，30.8mmol)。搅拌混合物过夜并回流2小时。除去溶剂，过滤得到固体并用乙醚洗涤，以97％的产率得到所需产物。
C.合成(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-氨基甲酸叔丁酯
向(2-氧代-吡咯烷-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(40)(1g，5mmol)的干燥DMF(25ml)溶液中依次加入氢化钠(60％，240mg，6mmol)和溴二苯基甲烷(1.36g，5.5mmol)。混合物于100℃加热18小时，然后冷却并真空除去溶剂。残留物溶解于乙酸乙酯(50ml)并用水(2×10ml)洗涤。MgSO4干燥，减压除去溶剂得到固体，然后用乙醚洗涤固体，以93％的产率得到所需产物。
D.合成3-氨基-1-二苯甲基-吡咯烷-2-酮 向(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-氨基甲酸叔丁酯(41)(1.2g，3.26mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液中加入CF3CO2H(8ml)。于室温在氮气气氛中搅拌得到的混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯并用饱和的碳酸氢钠(溶液)(20ml)洗涤。MgSO4干燥有机相并蒸发至干。得到的残留物使用CH2Cl2∶MeOH(10∶1)经柱层析纯化以97％的产率得到所需产物。
E.合成终产物在氮气气氛中向3-氨基-1-二苯甲基-吡咯烷-2-酮(42)(0.2g，0.75mmol)的干燥CH2Cl2(20ml)溶液中加入3，3-二苯基丙酸(0.19g，0.82mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.18g，0.9mmol)和DMAP(催化量)，反应混合物在氮气气氛中于室温搅拌过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(100ml)。用水(25ml，2×)和10％NaOH(25ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用己烷∶乙酸乙酯(2∶1)经柱层析纯化以70％的产率得到所需产物。
实施例16合成1-二苯甲基-3-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-脲
在氮气气氛中向3-氨基-1-二苯甲基-吡咯烷-2-酮(42)(0.2g，0.75mmol)的干燥CH2Cl2(15ml)溶液中滴入异硫氰酸二苯基甲酯(0.17mg，0.82mmol)。得到的混合物于室温搅拌两天，然后回流5小时。减压除去溶剂后使用己烷∶乙酸乙酯(2∶1)经柱层析以65％的产率得到所需产物。
实施例17合成N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-乙酰胺 在氮气气氛中向3-氨基-1-二苯甲基-吡咯烷-2-酮(42)(0.2g，0.75mmol)的干燥CH2Cl2(20ml)溶液中加入二苯基氨基乙酸(0.19g，0.82mmol)。向反应(体系)中加入EDC(0.18g，0.9mmol)和DMAP(催化量)并于室温在氮气气氛中搅拌反应混合物过夜。然后减压浓缩反应混合物。残留物溶解于乙酸乙酯∶水(10∶1)(100ml)。用水(25m1，2×)和10％NaOH(25ml)洗涤有机相，MgSO4干燥并蒸发至干。得到的残留物使用己烷∶乙酸乙酯(2∶1)经柱层析纯化以69％的产率得到所需产物。
实施例18合成2-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基-氨基)-N，N-二苯基乙酰胺
在氮气气氛中向3-氨基-1-二苯甲基-吡咯烷-2-酮(42)(0.2g，0.75mmol)的干燥DMF(15ml)溶液中加入2-溴-N，N-二苯基乙酰胺(0.24g，0.82mmol)和NaH(50mg)。反应混合物于100度加热过夜。冷却后蒸发除去溶剂，用乙酸乙酯(50ml)溶解残留物并用水(2×10ml)洗涤。MgSO4干燥有机相并蒸发至干。得到的残留物使用己烷∶乙酸乙酯(2∶1)经柱层析纯化以73％的产率得到所需产物。
实施例19评价钙通道阻断活性以5mM钡作为电荷载体，用全细胞贴片(patch)记录法测定对瞬时表达大鼠α1B+α2δ+β1b通道(N-型通道)的人胚肾细胞的钙通道阻断活性。也测定了P/Q-型通道(α1A+α2δ+β1bcDNA亚单位)和L-型通道(α1c+α2δ+β1bcDNA亚单位)的通道阻断活性。
HEK 293宿主细胞(ATCC#CRL 1573)培养于补加了2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清的标准DMEM培养液中。用脊椎动物表达载体中的大鼠α1B+β1b+α2δN-型钙通道亚单位通过标准钙-磷酸盐-DNA共沉淀法转染HEK 293细胞(例如，参见《当代分子生物学方法》(Current Protocols in MolecularBiology))。
孵育24-72小时后，除去培养液并用外部记录溶液(见下文)代替。使用与装有pCLAMP软件的IBM兼容个人电脑相连的Axopatch 200B放大仪(AxonInstruments，Burlingame，Calif.)进行全细胞贴片夹实验。抛光硼硅酸盐玻璃贴片移液管(Sutter Instrument Co.，Novato，Calif.)(Microforge，Narishige，Japan)，使之在装满甲磺酸铯内标溶液(组成以MM表示109 CsCH3SO4，4MgCl2，9EGTA，9HEPES，pH 7.2)时电阻约4MΩ。将细胞孵育在5mM Ba++(以mM表示5BaCl2，1MgCl2，10HEPES，40氯化四乙铵，10葡萄糖，87.5CsCl pH7.2)中。通过一串0.066Hz、-100mV和/或-80mV到各种电位(最小-20mV，最大+30mV)的100ms试验脉冲来产生所示电流数据。使用微灌注系统将药物直接灌注到细胞附近。
用Hill方程拟合(Sigmaplot 4.0，SPSS Inc.，Chicago，IL.)标准化的剂量-反应曲线来测定IC50值。以+10mV的增幅进行5s灭活预脉冲后，将稳态灭活曲线作成标准化测试脉冲幅度图。用Boltzman方程(I峰(标准化)＝1/(1+exp((V-Vh)z/25.6))拟合(Sigmaplot 4.0)灭活曲线，其中V和Vh分别是条件(conditioning)灭活电位和半灭活电位，z是斜率因子。
使用同一方案测试表达P/Q-型通道和L-型通道的细胞系。
图2显示化合物P1对N-型钙通道的选择性胜过对L-型和P/Q-型通道的选择性。P1对N-型通道的选择性比对P/Q-型通道的选择性高约23倍，对N-型通道的选择性比对L-型通道的选择性高75倍。
图3显示化合物P2对N-型钙通道的选择性胜过对L-型和P/Q-型通道的选择性。P2对N-型通道的选择性比对P/Q-型通道的选择性高约9倍，对N-型通道的选择性比对L-型通道的选择性高1000倍。
图4显示化合物P4对N-型钙通道的选择性胜过对L-型和P/Q-型通道的选择性。P4对N-型通道的选择性比对P/Q-型通道的选择性高约12倍，对N-型通道的选择性比对L-型通道的选择性高5000倍。
图5显示化合物P2对N-型钙通道的选择性胜过对L-型和P/Q-型通道的选择性。P5对N-型通道的选择性比对P/Q-型通道的选择性高约31倍，对N-型通道的选择性比对L-型通道的选择性高2000倍。
实施例20各种本发明化合物的N-型通道阻断活性(本实施例)根据略微改进的实施例11所述方法，这可以从以下描述中得以理解。
A.转化HEK细胞在用大鼠脑N-型钙通道亚单位(α1B+α2δ+β1bcDNA亚单位)稳定转染的人胚肾细胞，HEK 293中测定了N-型钙通道的阻断活性。简言之，细胞于37℃，5％CO2条件下培养在达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(Dulbeccomodified eaglemedium)(DMEM)中，该培养基补充了10％胎牛血清、200U/ml青霉素和0.2mg/ml链霉素。当85％融合时，用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA分离(split)细胞并以10％融合接种于玻璃盖玻片上。12小时后，更换培养液，用标准磷酸钙方法与合适的钙通道cDNA转染细胞。补充新鲜的DMEM并将细胞转移至28℃/5％CO2条件下。细胞孵育1-2天进行全细胞记录。
B.测定抑制作用使用与装有pCLAMP软件的个人电脑相连的Axopatch 200B放大器(AxonInstruments，Burlingame，CA)进行全细胞贴片夹(patch clamp)试验。外部和内部记录溶液分别含有5mM BaCl2、10mM MgCl2、10mM HEPES、40mMTEACl、10mM葡萄糖、87.5mM CsCl(pH 7.2)和108mM CsMS、4mM MgCl2、9mM EGTA、9mM HEPES(pH 7.2)。通常使用Clampex软件(Axon Instruments)，从-80mV到+10mV的维持电位引发电流。应用化合物之前通常先以低频刺激(0.067Hz)产生电流并使之稳定。然后在2-3分钟低频脉冲列(train)期间应用化合物来评价增强的阻断作用(tonic block)，接着将脉冲频率增至0.2Hz以评价频率依赖性阻断作用。使用Clampfit(Axon Instruments)和SigmaPlot 4.0(JandelScientific)分析数据。
下表2显示了N-型通道所获得的具体数据表2对N-型钙通道的阻断作用


实施例21各种本发明化合物的T-型通道阻断活性采用标准贴片夹技术来鉴定T-型电流阻断剂。简言之，上述稳定表达人α1GT-型通道的HEK细胞系用于所有记录(通路#4-20，37℃，5％CO2)。为获得T-型电流，用外部溶液(表3)替换培养液后，将含有半融合细胞的塑料平皿置于ZEISS AXIOVERT S100显微镜的平台上。用装配在电阻值约5MΩ的SUTTER P-97拔出器(puller)上的移液管(带细丝的硼硅玻璃，O.D.1.5mm，I.D.0.86mm，长10cm)得到全细胞贴片(表4)。
表3外部溶液500ml-pH7.4，265.5mOsm

表4内部溶液50ml-pH7.3，含CsOH，270mOsm


通过使用两种电压方案获得可靠的T-型电流“非-灭活”和“灭活”。在非灭活方法中，维持电位设置于-110mV，先在-100mV进行预脉冲1秒，再在-40mV进行测试脉冲50毫秒。在灭活方法中，在约-85mV进行预脉冲1秒，这使得约15％的T-型通道灭活。

将测试化合物溶解于外部溶液，0.1-0.01％DMSO中。静置约10分钟后，通过重力用WPI微丝管(microfil tubing)将其施加于靠近细胞处。用“非灭活”预脉冲测定化合物的静息阻断作用。采用“灭活”方法研究电压依赖性阻断作用。然而，以下初步数据主要是只用非灭活方法得到的。各种本发明化合物的IC50值见表5。
表5α1GT-型通道的阻断作用


实施例22本发明化合物在福尔马林诱导的疼痛模型中的活性测定了鞘内递送的本发明化合物对大鼠福尔马林模型的作用。将化合物重建为约10mg/ml的丙二醇储备溶液。为每个测试化合物随机挑选8只275-375克大小的Holtsman雄性大鼠。
使用表6所示以下研究组，腹膜内(IP)递送了测试物、运载体对照(丙二醇)和盐水表6福尔马林模型剂量组

N/A＝不适用药物递送之前，收集基线行为(baseline behaviroal)和测试数据。输注测试物和对照物后在选定的时间再次收集这些数据。
在测试期间的早晨，将一小金属环(0.5g)宽松地围绕在右后爪上。将大鼠置于圆柱形Plexiglas小室中适应30分钟。给予测试物和运载体对照物，10分钟后将福尔马林(50μl 5％的福尔马林)注射入大鼠右后爪的后背面。然后将大鼠置于自动福尔马林装置小室中，监测注射了福尔马林的爪子的运动情况并记录下一60分钟期间每分钟爪子收缩的次数(Malmberg，A.B.等，同上)。
结果以最大可能的作用±SEM表示，其中盐水对照＝100％(表7)。
表7本发明化合物在福尔马林诱导的疼痛模型中的效力

应该理解以上的详细描述以及实施例仅是说明性的，不能理解为是对本发明范围的限制。所公开的实施方案的各种变化和改进形式对本领域技术人员而言显而易见。可作出包括(但不限于)和化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成方法、制剂和/或本发明的使用方法相关的变化和改进形式而不脱离本发明的构思和范围。本文引用的美国专利和申请引作参考。
权利要求
1.一种如下式所示化合物 或它们的盐，包括它们所有的立体异构体形式X1是CR3或N；W是L2-A3或X1(A1)(A2)；各L1和L2是C1-C10任选取代的亚烷基或C2-C10任选取代的亚烯基，其中一个或多个所述的C任选被选自N、O或S的杂原子取代，或用＝O进一步取代，或同时为二者所取代；各A1、A2和A3独立为任选含有一个或多个选自N、O或S的杂原子的任选取代的5-、6-或7-元脂族环或芳香环，并任选稠合到其它环；R1和R2是非干扰性取代基；和R3是H或非干扰性取代基；前提是如果L1少于3个连接原子则R2不能为氢，或者如果R2是氢则L1必须含有C＝O。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1是C1-C6烷基、C2-C6烯基或C2-C6炔基，各取代基可以是任选取代的并任选含有一个或多个选自O、N和S的杂原子，或者R1是无机取代基，或者两个R1形成＝O或＝NOH，n是0-3。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述R1是卤素、NO2、SO2、SO、NO、＝O、＝NOH或COOR，其中R是H或C1-C6烷基。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R2是H、低级烷基或低级烯基。
5.如权利要求4所述的化合物，其特征在于，R2是H或甲基。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，L1是任选被＝O所取代的C1-C8亚烷基或C1-C8亚烯基。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，L1是被＝O所取代。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述＝O与式1中的NR2毗连，或与式2中吡咯烷基环上的氮原子毗连。
9.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，各A1、A2和A3独立为任选取代的苯基、环己基、2-、3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、哒嗪基、苯并三唑基或苯并咪唑基。
10.如权利要求9所述的化合物，其特征在于，所述各A1、A2和A3被卤素、烷氧基或烷基取代。
11.如权利要求9所述的化合物，其特征在于，所述各A1、A2和A3独立为苯基、环己基、吡啶基或嘧啶基。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，各A1、A2和A3为任选地被卤素取代的苯基。
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，W是L2-A3，A3是苯基、环己基、2-、3-或4-吡啶基、吲哚基、2-或4-嘧啶基、哒嗪基、苯并三唑基或苯并咪唑基，其中各基团任选地被一个或多个取代基取代。
14.如权利要求13所述的化合物，其特征在于，A3是任选被卤素、烷氧基或烷基取代的苯基或吡啶基。
15.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-N-甲基-苯甲酰胺；(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(R)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-4-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-3-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-4-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-3-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(R)-N-甲基-3，3-二苯基-N-[1-(苯基-吡啶-2-基-甲基)-吡咯烷-3-基]-丙酰胺(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-4-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(S)-N-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-N-甲基-乙酰胺；(S)-2-[(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-甲基-氨基]-N，N-二苯基-乙酰胺；(S)-3-二苯甲基-1-(1-二苯甲基-吡咯烷-3-基)-1-甲基-脲；(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-3-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(S)-N-甲基-3，3-二苯基-N-(1-吡啶-2-基甲基-吡咯烷-3-基)-丙酰胺；(R)-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-吡咯烷-3-基}-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苄基)-甲基-胺；(R)-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-吡咯烷-3-基]-甲基-胺；(S)-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-吡咯烷-3-基}-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-甲基-胺；(S)-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己基]-[1-(3，5-二-叔丁基-4-甲氧基-苄基)-吡咯烷-3-基]-甲基-胺；(R)-N-{1-[(4-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(4-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[(3-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(3-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[(2-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-{1-[(2-氯-苯基)-苯基-甲基]-吡咯烷-3-基}-N-甲基-3，3-二苯基-丙酰胺；(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-3，5-二叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(3，5-二叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(R)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-4-叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(R)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(4-叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-{1-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基]-吡咯烷-3-基}-4-叔丁基-N-甲基-苯甲酰胺；(S)-6，6-双-(4-氟-苯基)-己酸[1-(4-叔丁基-苯甲酰基)-吡咯烷-3-基]-甲基-酰胺；(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-4-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-3-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；(S)-N-甲基-N-[1-(1-甲基-哌啶-2-基甲基)-吡咯烷-3-基]-3，3-二苯基-丙酰胺；4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸乙酯；4-[6，6-双-(4-氟-苯基)-己酰基氨基]-1-(3，5-二叔丁基-4-甲氧基-苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸；1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸乙酯；1-二苯甲基-4-(3，3-二苯基-丙酰基氨基)-吡咯烷-2-羧酸；N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-3，3-二苯基-丙酰胺；1-二苯甲基-3-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-脲；N-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基)-2-二苯基氨基-乙酰胺；和2-(1-二苯甲基-2-氧代-吡咯烷-3-基氨基)-N，N-二苯基-乙酰胺。
16.一种含有如权利要求1所述的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
17.一种含有如权利要求15所述化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
18.一种调节对象的钙通道活性的方法，包括给予需要这种治疗的对象权利要求1所述化合物或其药物组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述钙通道活性与以下疾病相关中风、焦虑、膀胱反应过度、炎性肠病、头部创伤、偏头痛、慢性、神经病理性和急性疼痛、癫痫、高血压、心律不齐、神经疾病、心血管疾病、精神病、精神分裂症、抑郁症、药物和酒精成瘾与戒除、癌症、糖尿病、不育症和性功能障碍。
20.一种缓解对象疼痛的方法，包括给予需要这种治疗的对象权利要求1所述的化合物或其药物组合物。
全文摘要
本发明涉及式(1)或式(2)的3－氨基吡咯烷衍生物，其中，X
文档编号A61K31/40GK1976920SQ200580006161
公开日2007年6月6日 申请日期2005年1月21日 优先权日2004年1月22日
发明者海森·帕茹赫希, 侯赛因·帕茹赫希, Y·丁, T·P·斯诺切 申请人:神经医药品有限公司