r>[0048] (5)将测序引物5' -CCCAAACAAACCCTACTC-3'与磁珠固定的其中一份单链DNA 模板模板在反应体系（l〇mM Tris-HCl, 2M NaCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸钠），0. 1% Tween 20, pH 7. 6)80°C下杂交5min，然后自然冷却至室温，完成杂交；
[0049] (6)焦测序反应体系包括0? 1M Tris-Ac (pH 7. 7)，2mM EDTA (乙二胺四乙酸 钠），10mM Mg(Ac)2,0.2%BSA(小牛血清蛋白），10mM DTT(二巯苏糖醇），10mM APS(磷 酰硫酸腺），〇. 4mg/mL PVP (聚乙烯吡咯烷酮），4mM D-luciferin (虫荧光素），2U/mL ATP sulfurylase (三磷酸腺苷硫酸化酶），0? 4mM luciferase (焚光素酶），2U/mL apyrase VII (三磷酸腺苷双磷酸酶VII)，2U/mL DNA聚合酶I (Klenow fragment, exo -);焦测序反 应体系与上述（4)杂交产物混合用于测序反应；
[0050] (7)将上述（6)的反应体系置于焦测序仪（PSQ 96MA system(Biotage AB, Uppsala, Sweden))中，按照表1的顺序依次分别加入两核苷酸进行焦测序，得到由按照 先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息图2 ;根据图2提取匕、F4、F7、F9、Fn转 化为核苷酸数目的信息（l〇au的峰强度相当于一个核苷酸），并构建方程组：
[0051] Fi= 0? 69 = l_x !
[0052] F4= 0. 58 = 1-x 2
[0053] F7= 0. 63 = 1-x 3
[0054] F9= 0. 53 = 1-x 4
[0055] Fn= 0. 49 = 1-x 5
[0056] 便可以求出 x!= 0? 31、x 2= 0? 42、x 3= 0? 37、x 4= 0? 47, x 5= 0? 51，即为五个位 点的甲基化程度。
[0057] 表1. 100%甲基化或未甲基化PCR产物DNA模板的理论测序结果
[0058]
[0059] 注：GT表示（dGTP+dITP)，依次类推
[0060] DNA1 表示 100% 甲基化序列：CTTAGCGAGCGCAAGAGCTGTAGGGTTAG
[0061] DNA2 表示 100%未甲基化序列：ITTAGTGAGTGTAAGAGTTGTAGGGTTAG
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其步骤包括：1)DNA 提取；2)亚硫酸氢盐处理；3) PCR扩增；4)测序；5)关联分析； 所述步骤4)的测序方法为：每个测序反应同时加入两种不同的核苷酸，得到由连续单 个测序信息构成的一组测序编码信息。2. 如权利要求1所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤4)的具体方法包括以下步骤： 4-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰 的DNA链固定到所述磁珠上，在0. 05-0. 2M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清 除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板； 4-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C下放 置5-10min，自然冷却至室温，完成杂交； 4-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤3-2)得到的杂交产物混合，单个测序反 应选择两核苷酸组合为（dATP a S+dCTP)、（dATP a S+dTTP)、（dGTP+dITP)、（dCTP+dGTP)、 (dCTP+dTTP)之一进行；连续测序反应选择不同的两组两核苷酸组合循环进行，或者根据 分析的目标序列优化两核苷酸加入的顺序进行。3. 如权利要求2所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤4-2)中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列。4. 如权利要求1或2所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于： 所述步骤4)中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信号强度信 息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均能够 转化为核苷酸合成的数目。5. 如权利要求1所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤5)中，根据两核苷酸合成焦测序得到的一组测序反应获得编码信息，测序信号强度 信息是包含零的正整数，或者是正非整数。6. 如权利要求5所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤5)的具体步骤为： 假定DNA分析片段内所有GC位点碱基"C"全被甲基化，得到一条100%被甲基化的 DNA模板1序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息；同时，假 定DNA分析片段内所有GC位点基"C"全未被甲基化，得到一条100%未被甲基化的DNA模 板2序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息； 所述关联分析为：假定容易一个GC位点中C被甲基化的程度为X1，其中0彡X1S 1， 那么，在经过亚硫酸氢盐处理的PCR产物这个碱基序列中，含有"C"的DNA模板序列含量为 X1，而含有由这个碱基未被甲基化转化而来的"T"DNA模板序列含量则为（I-X 1);某个实际 测序反应得到的信号强度即核苷酸合成数目等于DNA模板1序列和DNA模板2序列合成测 序贡献之和，并由此构建出相应的方程式或方程组，求出^值，确定该位点的甲基化程度； 当i = 1，DNA模板1序列含量为Xl，DNA模板2序列含量为（I-X1); 当i = 2,该"C"碱基之前的DNA模板1序列含量为X1，该"C"碱基及其之后的DNA模 板1序列含量为x2;由该"C"碱基转化成"T"碱基之前的DNA模板2序列含量为（1-x D，由 该"C"碱基转化成"T"碱基及其之后的DNA模板2序列含量为（I-X2); 依次类推，当i = i，该"C"碱基之前的DNA模板1序列含量为X1 i，该"C"碱基及其之 后的DNA模板1序列含量为X1;由该"C"碱基转化成"T"碱基之前的DNA模板2序列含量 为（I-X 1 D，由该"C"碱基转化成"T"碱基及其之后的DNA模板2序列含量为（I-X1);将整 过PCR产物测序信息上甲基化完成关联分析。7. 如权利要求1所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤2)中，通过采用传统的亚硫酸氢盐转化方法，或者采用市售的试剂盒、按照其操作 流程实施。8. 如权利要求1所述的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所 述步骤3)中，PCR扩增所用的PCR -条引物为5 '端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰， 与表面修饰链霉亲合素、羧基的固相载体反应，或者与丙烯酰胺单体聚合反应制备单链DNA 模板。
【专利摘要】本发明公开了一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物进行两核苷酸合成焦测序，连续记录每个测序反应得到包括两核苷酸种类及其核苷酸合成数目的测序编码信息。通过设定已确定的目标区域序列中所有CG位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用两核苷酸合成焦测序得到的信息，进行关联分析，实现目标区域序列中甲基化的定量分析。本发明能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化分析。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105132573
【申请号】CN201510623069
【发明人】肖鹏峰, 刘文斌
【申请人】东南大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月25日