R扩增牛基因组DNA得到620bp的特 异扩增片段（SEQ ID N0:1)。测序结果发现，在该620bp片段中，由于第403bp处存在G -T 的突变，从而导致作加/酶切位点（GACNN'NNGTC)的产生，其中，399-400bp间为作加/酶的 多态性切点。
[0019] 限制性内切酶可自行选择。本发明中为达到高效、高速的效果，选用MBI Fermentas Life Science (MBI公司）的/内切酶。PCR产物酶切反应体系为16 yl, 其中 lOXBuffer Tango[内切酶包装盒中提供，含 330mM Tris-acetate (PH7.9)，100mM magnesium acetate, 660mM potassium acetate, lmg/ml BSA] 1. 6 y 1，PCR产物 5. 0 y 1，限 制性内切酶0 y 1 (总量10U，内切酶包装盒中提供），二馏水8. 4 y 1，将样品混合均 匀后37°C恒温水浴8小时。恒温水浴结束后，取10 y 1酶切产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检 测酶切结果，记录基因型检测结果。PCR扩增产物经酶切产生三种基因型，经2%琼 脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型。如图2所示，其中TT型只有620bp -条带，TG型含有 620bp, 399bp, 221bp 三条带，GG 型有 399bp 和 221bp 两条带。
[0020] 三、标记性状关联分析 利用实验群体为实验对象进行性状关联分析，使用SPSS19. 0软件，General Linear Model过程，建立如下模型进行性状关联分析： 统计分析模型为：Yi^y+Bk+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产性能表型值；y为 生产性能的最小二乘均值；Bk为品种对生产性能的效应值为基因型对生产性能的效应 值；61为对应于观察值的随机残差。
[0021] 本发明中牛因的扩增序列多态位点与牛超数排卵性状的关联分 析表明，在随机选取的441个体中，GG型个体有65个，TG型个体有224个，TT型个体有152 个。不同个体所拥有的不同超数排卵性状，包括可用胚胎数、总胚胎数、M2级（2级桑葚胚） 胚胎数、Ml级（1级桑葚胚，优于M2级胚胎）胚胎数之间显著差异分析结果(最小二乘均值 土标准误）见表1。
[0022] 表1不同基因型个体超数排卵性状之间显著差异分析结果
注：肩标带有不同大写字母表示差异极显著（P〈〇. 01)。
[0023] 分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的一些超数排卵性状存在极 显著的差异。总体来说，TT型个体的超数排卵性状普遍优于GG型个体，用于选择超数排卵 供体时，应优先选择TT型个体，而尽量不选择GG型个体。
[0024] 实施例2 在河北天和肉牛养殖有限公司的待超排母牛群体中随机选定16个待超数排卵个体， 采集血液进行基因组DNA提取，并利用本发明设计的引物、PCR反应体系和条件进行PCR 扩增。取l〇.〇yl的2XMaster Mix,正向引物与反向引物(浓度为均为10pmol/yl)各 〇.5yl,基因组 DNA 0.5yl (含 10-50ngDNA)，二馏水 8.5yl。PCR 反应条件为：94°C预变 性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环，72°C最后延伸5 分钟。
[0025] 扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示为特异性PCR产物。如图4所示， 其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-16为被检测的PCR产物。将PCR产物按本发明 设计的RFLP方法进行酶切反应。PCR产物酶切反应体系为16yl，其中lOXBuffer Tango 1. 6 y 1 ，PCR产物5. 0 y 1，限制性内切酶0 y 1，二馏水8. 4 y 1，将样品混合均匀后 37°C恒温水浴8小时。为提高酶切反应效率，可每隔1小时将反应管取出，将部分蒸发的液 体轻甩到管底部。恒温水浴结束后，取10 y 1酶切产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结 果。如图5所示，其中M泳道为标准分子量Marker，泳道1-16为被检测的酶切产物。经鉴 定，个体1、6、7、14属于17型 ；个体4、8、12、13、15、16属于了6型；个体2、3、5、9、10、11属于 GG型。
[0026] 待此16个个体超数排卵后，以相关超数排卵性状数据进行关联分析，利用 SPSS19.0 软 General Linear Model 过程，Y^py+Bk+Gj+ei。其中，Yi为被观测个体的生产 性能表型值；y为生产性能的最小二乘均值；Bk为品种对生产性能的效应值；6,为基因型 对生产性能的效应值； 61为对应于观察值的随机残差。
[0027] 基因型检测结果表明，在此16个个体中，TT型个体有4个，TG型个体有6个，GG 型个体有6个。不同基因型与超数排卵性状之间显著差异分析结果(最小二乘值和标准误） 见表2。
[0028] 表2不同基因型个体之间超数排卵性状显著差异分析结果
注：表中最小二乘均值土标准误肩标带有相同字母的表示差异不显著（P>〇. 05);带有 不同字母表示差异显著（P〈〇. 05);均带有不同大写字母表示差异极显著（P〈0. 01 )。
[0029] 分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体，其超数排卵性状存在显著 或极显著的差异，TT型个体的超数排卵性状优于TG型和GG型。
【主权项】
1. 锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，其特征在于： 该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1 ;在序列表SEQ ID NO: 1第403位存 在G-T的碱基突变，该突变导致/^A4/-RFLP多态性的产生。2. 扩增如权利要求1所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示： ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3' 正向引物 ZNF33B-R: 5' - GGTTCTGTTCTTGAITTGC -3' 反向引物。3. 锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的检测方法，包括以下步骤： 通过设计特异性引物一对，正向引物ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3'和反 向引物ZNF33B-R: 5'- GGTTCTGTTCTTGAITTGC -3'，从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR 扩增，获得因片段的DNA序列，如表SEQ ID NO: 1 ;利用限制性内切酶作加/检测 PCR产物片段的DNA序列第403位的G-T碱基突变，PCR扩增产物经酶切产生三种基 因型，经2%琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型，将检测结果所示的不同基因型与牛超数 排卵性状关联分析，具备特定的基因型的个体将获得更好超数排卵效果。4. 权利要求1所述的分子标记在牛优良超数排卵性状标记辅助选择中的应用。
【专利摘要】本发明公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，该分子标记的核苷酸序列如序列表？SEQ？ID？NO:1；在序列表？SEQ？ID？NO:1第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致<i>PshAI</i>-RFLP多态性的产生，鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132579
【申请号】CN201510663394
【发明人】张嘉保, 李树静, 李常红, 余文莉, 姜昊, 陈龙, 毕江华, 冯春涛, 陈承祯, 袁宝, 高妍
【申请人】吉林大学, 河北天和肉牛养殖有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月15日