一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及环境微生物分析技术领域，具体设及城市污水处理厂/处理站微生物 气溶胶中全部微生物的检测分析方法。
【背景技术】
[0002] 生物气溶胶是指具有生命的气溶胶粒子（包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子）和 活性粒子（花粉、抱子等）W及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒。污水中存 在的多种微生物，在污水处理过程中，曝气、机械揽拌及污泥脱水等环节可使其W气溶胶的 形式释放周边的空气中。研究表明，城市污水处理厂/处理站逸散的微生物气溶胶中含有 大量的致病菌或条件致病菌，对污水处理厂/污水处理站工作人员、附近居民健康及环境 具有较大的潜在危害。因而，探明城市污水处理厂、污水处理站微生物气溶胶的群落结构， 解析生物气溶胶的微生物菌群在逸散过程中的演替规律逸散特征，对于污水处理厂微生物 气溶胶的控制及人员健康防护都具有重要的研究和指导意义。
[0003] 目前，城市污水处理厂/处理站（wastewatertreatmentplant/station，简称 WWTP/WWT巧逸散的微生物气溶胶采集方法主要包括可培养方法和不可培养方法两种。
[0004] 1)琼脂培养基-Andersen固体撞击式采样法是国际标准的可培养微生物气溶胶 采集方法，可对微生物气溶胶的群落结构、浓度W及粒径分布等特征进行研究。该方法为传 统的微生物培养方法，操作繁琐，需要大量的人力物力；而研究也表明，可培养的微生物仅 占环境微生物的1% -10%，因而，该方法并不能高效、有效地反映城市污水处理厂微生物 气溶胶的分布及组成特征。 阳0化]2)SKC-Sampler液体撞击式采样法是国际标准的微生物气溶胶不可培养采集方 法，作为标准方法广泛应用于气溶胶中全部微生物的收集，对于微生物群落信息能够较全 面的反映。获取微生物气溶胶的DNA是后续微生物特征解析的前提，但是，空气中的微生物 数量相对于其他生境（±壤、水体）要低很多，不经培养过程直接对空气中的微生物提取 DNA是一直W来的难题。
[0006]SKC-Sampler液体采样器流量小（额定流量为12.化空气/min)，要获取足够的样 本量提取dm需要长时间的样品收集；该方法中的微生物气溶胶收集液（PBS缓冲液）在样 品采集过程中会大量挥发，需要反复添加收集液W保证其正常运行；同时，受制于其收集液 在低溫条件（< 〇°C)下会结冰，该方法并不能完成在任一时间的样品采集任务。
[0007] 参考常见的大流量大气采样器（流量> 10化/min)的大气采样器一般安装于某固 定采样点，而对于不同污水处理厂/处理站之间的调研安排、W及多个采样点之间频繁更 换的要求并不能满足。
[0008] W上缺点，使得两种国际标准的生物气溶胶采集方法，都不能实现对城市污水处 理厂微生物气溶胶中全部微生物的现场采样目的，W及后续的微生物群落结构及逸散特征 的解析。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中全部 微生物高效采集和分析的方法，即能够克服营养琼脂-Andersen固体撞击式采样法和 SKC-Sampler液体撞击式采样法应用于城市污水处理厂微生物气溶胶收集过程中的弊端。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0011] 一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，包括W下步骤：
[0012] 1)采样器及其配件准备，采样膜及其采样膜收集器具的准备及高溫高压灭菌；
[0013] 2)城市污水处理厂微生物气溶胶现场采样，运行空气采样累，抽滤空气至无菌的 玻璃纤维滤膜上，截留空气微生物至采样膜上，记录采样过程中的气象参数；
[0014] 3)采样膜的收集及存放，用无菌綴子将截留空气微生物的采样膜转移至无菌侣锥 纸上密封，如不能立即对样品进行后续处理，将其冻存-20°C或者-80°C的冰箱内待用；
[0015] 4)DNA提取，提取玻璃纤维膜上的微生物DNA;
[0016] 5)目的片段扩增，细菌16SrRNA和真菌18S基因PCR扩增；
[0017] 6)高通量测序，利用高通量测序技术对细菌和真菌的目的序列进行测序；
[0018] 7)序列分析，将下机的目的片段DNA序列对原始数据进行过滤处理，得到优化序 列，去除嵌合体序列后进行0TU聚类分析，对0TU的代表序列在Silva数据库中进行比对分 析，鉴定微生物气溶胶中细菌和真菌的分类；
[0019] 8)群落结构及多样性分析，根据鉴定的细菌和真菌的分类信息，对微生物气溶胶 的群落结构和多样性进行分析；
[0020] 还可W包括：
[0021] 9)源解析及逸散规律评估，比较不同污水处理工段微生物气溶胶样品之间的相似 性，同时对城市污水处理厂微生物气溶胶进行源解析，W综合评估微生物气溶胶的逸散特 征；
[0022] 10)特征序列数据库的构建，建立城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中特征 的细菌和真菌序列信息数据库，尤其是致病菌的序列信息。
[0023] 该检测方法可W应用于不同运行工艺及不同气象条件下的污水处理厂/污水处 理站微生物气溶胶的检测，即室内和室外大气环境均可实现。
[0024] 为了更好地实现本发明目的，进一步的技术方案如下：
[00巧]所述步骤1)中采样器为中流量总悬浮微粒采样器，配W总悬浮颗粒物（Total SuspendedParticulate,简称TS巧的颗粒物切割器，采样膜为亲水性的玻璃纤维膜，采样 膜收集器具包括无菌的綴子、侣锥纸、自封袋、直径为90mm的玻璃平板或者无菌一次性塑 料培养皿，由于在城市污水处理厂/处理站内电力的使用受到严格管制，所W需要额外自 备电力输出线圈若干（因现场情况决定），线路连接完毕，将灭菌的TSP切割器和滤膜安装 于采样累上，即可完成采样点的微生物气溶胶样品的采集。
[00%] 所述步骤2)中采样累安装高度为人呼吸高度，即距地面垂直高度1. 5m处；对于污 水处理厂的生物处理单元处，分别在水面处、距地面垂直高度1. 5m处、距地面垂直高度4m处设置Ξ个采样点。采样流量为10化/min,玻璃纤维膜为直径90mm、对0. 3μm标准粒子的 截留率>99. 95%的圆形采样膜，采样时间设置为比，2h，地，她，1化和2地，采样的同时记录 当时的气象条件。
[0027] 所述步骤3)中无菌綴子和无菌侣锥纸，事先在高溫、高压灭菌锅中用牛皮纸或者 耐高溫、高压容器包裹，121°C灭菌15min。
[0028] 所述步骤4)中玻璃纤维膜的颗粒物上附着的微生物的总DM提取包括W下仪 器、器具和试剂：低溫低速离屯、机、真空隔膜累、玻璃过滤系统、剪刀、綴子、50mL血清瓶、 1XPBS缓冲液，孔径为0. 22μm、直径为25mm的聚酸讽滤膜（PES)，DNA提取试剂盒，除离 屯、机和抽滤累外，其他均需在12rC灭菌15min;总DNA的提取方法如下：将冻存于-20°C或 者-80°C的冰箱内的玻璃纤维膜样品置于超净台中，用无菌的綴子夹取采样膜，用无菌剪刀 将其剪碎置于无菌的50mL血清瓶中，取40mL无菌的1XPBS缓冲液冲洗剪碎的采样膜并将 其浸没，封盖后上下颠倒血清瓶数次，尽可能多地冲洗采样膜的颗粒物至缓冲液中，将其置 于低溫低速离屯、机中，200g离屯、化，安装真空过滤系统，将上述离屯、后的缓冲液（避开剪碎 的滤膜）倒入滤杯中，浓缩颗粒物至阳S膜上，用无菌綴子夹取该滤膜，用DNA提取试剂盒 对滤膜浓缩的颗粒物进行总DNA的提取，由于空气中微生物的总DNA含量较低，在总DNA提 取的最后一步，用50μL溶液收集总DNA，W提高总DNA的最终浓度。
[0029] 所述步骤W中目的片段的扩增，细菌16SrRNA扩增采用引物338F/806R(5'-AC TCCTACGGGAGGCAGCA-3' /5' -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），真菌 18S基因扩增引物采用引物 0817F/1196R(5' -TTAGCATGGAATAATRRMTAGGA-3' /5' -TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）。
[0030] 所述