br>[001引 W成年湖羊瘤胃、脾脏、肾脏等组织总RNA为模板，进行RT-PCR扩增、PCR产物 纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQIDNO:1所述cDNA序列；从绵羊血液 基因组中提取DNA，设计引物（该引物的序列为：正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG，反向 引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG)，PCR扩增、PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQ IDNO:2所示的核巧酸序列。通过序列比化筛查SNP，再利用上述引物的序列：正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG，反向引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG进行PCR扩增，将PCR扩增获 得的片段进行化ηI酶切分型及检测。
[0016] 应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQIDNO:2的第275位碱基突变进行了 检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅 助选择提供了 一个新的分子标记。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA 序列。序列长度为licnbp。其中第262 - 262bp处为等位基因突变。
[001引序列表SEQIDN0:2是本发明克隆的绵羊免疫性状相关基因ANXA10用于PCR-RFLP部分DNA序列（即本发明筛选的分子标记序列）。序列长度为34化P。其中第275 -275bp处为等位基因突变（C/T碱基替换）。
[0019] 序列表SEQIDN0:3是扩增绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA序列的正 向引物。
[0020] 序列表SEQIDNO:4是扩增绵羊免疫性状相关基因ANXA10的完整cDNA序列的反 向引物。
[002。 序列表SEQIDNO:5是扩增本发明筛选的分子标记的正向引物。
[002引序列表SEQIDNO:6是是扩增本发明筛选的分子标记的反向引物。
[002引 图1 :是本发明中绵羊ANXA10基因用于克隆的cDNA片段。序列长度为110化口。 该序列的下划线部分是设计的引物。
[0024]图2:是本发明中绵羊ANXA10基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。序列长度为 34化P。该序列的下划线部分是设计的引物。
[00巧]图3 :是本发明中绵羊ANXA10基因用于克隆的cDNA片段的凝胶电泳图。附图标记 说明：1 -7泳道为ANXA10基因llCnbp的片段；Μ泳道为DNA分子量标准值L20001adder)。
[0026] 图4:是本发明中绵羊ANXA10基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段的凝胶电 泳图。附图标记说明：1 - 6泳道为ANXA10基因34化P的片段；Μ泳道为DNA分子量标准 值L20001adder)。
[0027] 图5:是本发明中绵羊ANXA10基因DpnI-RFLP的立种基因型灯TCCCT)电泳 结果。附图标记说明，图中：1泳道为CT;2 - 6, 8泳道为CC;7泳道为TT;M泳道：DNA分子 量标准值L20001adder)。
[002引 图6 :是本发明中绵羊ANXA10基因第3外显子筛查SNP位点测序峰图（反向互补 链测序，正向应为C/T突变）。
【具体实施方式】
[0029] 实施例UANXA10基因的克隆
[0030] (1)引物序列设计
[0031]根据绵羊ANXA10 基因序列（GenBank收录号：XM_012159138. 1)，利用Prime巧.0 软件设计一对引物Μ-F和Μ-R，具体的DNA序列如下：
[0032]ANXAIO:M-F:5 ' -TTGAGTTCTTTCTAGGGACA-3 '，（即：SEQIDN0:3 所示的序 列）；
[0033]Μ-R:5 ' -GACGGCATACTCCAGGTT- 3 ';(即：SEQIDN0:4 所示的序列）。
[0034] 似PCR产物的克隆和测序
[003引将纯化后的PCR产物与pMD- 18T载体（购自宝生物工程大连有限公司）在4°C水浴过夜连接；无菌状态下取100~120μL感受态细胞于1. 5血邱endorff管中，将5μL 的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42°C热激90s，后冰浴3~4min，加入400μL无抗 生素的LB液体培养基，37°C振荡培养45min。取100μΙ涂布于异丙基硫代一β-D-半 乳糖巧（IPTG)X-gal的琼脂平板上，37°C平放比后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种 于2 - 3血LB中，37°C30化/min培养过夜。用1. 5血EP管1200化/min离屯、数秒收集菌 体进行制备少量的质粒。验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进 行测序，序列测定由上海英驗生物技术有限公司完成，得到一条长度为110Ap的cDNA序列 (见SEQIDN0:1 所述）。
[003引DNA序列同源性检索鉴定：
[0037] 通过美国国家生物技术信息中屯、（NCBI，化tionalCenterforBiotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST度asicLocalAlignment SearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基 因进行序列同源性比较，W鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与 绵羊ANXA10基因cDNA(GenBank收录号：XM_012159138. 1)的部分序列同源性达100%。 [003引实施例2、PCR-R化P诊断方法的建立 [00測 （1)、引物序列设计
[0040]ANXA10:M-F:5 ' -GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG- 3 '，（即：SEQIDN0:5 所示的序 列）；
[0041]Μ-R:5 ' -CAGAAGTTCGCATGGAAACG- 3 ';(即：SEQIDN0:6 所示的序列）。 [004引似PCR扩增条件
[004引PCR反应总体积20μL其中绵羊基因组DNA约10化g，含1倍的缓冲液（购自 Promega公司），1. 5mmol/LMgClz，dNTP终浓度为 150μmol/L，引物终浓度为 0. 4μmol/L， 2UTaqDNA聚合酶（Promega)。PCR扩增程序是：94°C3min，循环 35 次 94°C30s，58°C30s， 然后72°C25s，最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。得到34化p 特异扩增片段，该片段位于第3外显子（如图2)。测序的结果发现在该345bp片段中存在 一个化ηI酶切位点（GAITC)，其中第273bp处为多态性切点，位于第3外显子中（见图 3) 0
[0044] (3)PCR-R化P检测条件
[004引 PCR产物酶切反应体积是10μL其中1Xbuffer1μLPCR产物3~5μL限制性 内切酶DpnI为0. 3μL(10U)，用&0补足至10μL，将样品混匀后离心37°C水浴也用2% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子测序结 果显示，当第275bp位置为T时，则该化ηI酶切位点不存在，DpnI酶切后只有1个片段， 长度是37化P(定为等位基因T);但存在T275 -C275的替换时，其结果导致第275bp处一 个化ηI酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为273bp和7化P(定为等位基因C)，Ξ 种基因型ΤΤ、CC和CT如图4所述。
[0046] (4)本发明的分子标记在绵羊免疫性状标记性状关联分析中的应用
[0047] 试验共检测了 132只湖羊和49只湖杜湖羊（湖?X(杜泊羊?X湖羊毕）毕）的 多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状（白细胞计数（WBC)，红细胞计数（RBC)， 血红蛋白（HGB)，红细胞压积（肥Τ)，红细胞平均体积（MCV)，平均红细胞血红蛋白含量 (MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC)，血小板计数（PLT)，红细胞分布宽度（畑W)，血小 板体积分布宽度（PDW)，平均血小板体积（MPV)，血小板压积（PCT))的关联分析。建立如下 所述的最小二乘模型：
[0048] Yijik=y+Genotypei+Breedi+Sexi+Pk+Combinationm+εijikni
[0049] 其中，Yi,ki是性状观察值，μ为总体均数，Genotype1为基因型效应，Breed,为品种 效应，Sexi为性别效应，Pk为批次效应，Combinationm为组合的效应，εijimk为随机误差，假 定Eyimk相互独立，服从N(0,σ2)分布。基因型检测结果表明在181个个体中TC基因型 有50个，CC基因型有130个个体，ΤΤ型个体只有1个，在进行基因型与性状关联分析时提 出ΤΤ型个体。基因型与性状关联分析的结果是：ΑΝΧΑ10基因与平均红细胞血红蛋白浓度 呈显著相关。
[0050] 表1绵羊ΑΝΧΑ10基因g. 2750Τ化ηI酶切位点的多态性与部分免疫性状的关联 分析
[0051]
[005引由表1可知，ΑΝΧΑ10基因SNP位点对红细胞计数有显著影响（Ρ<0. 05)，其中CC基 因型个体的平均红细胞计数显著高于TC基因型个体的对应值。
【主权项】
1. 一种用于非诊断目的的与绵羊免疫性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如下所 示：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGGGGAGACAGAAGGCACCTCGGCCACGGCAGGGGTACCCTGAAACTTCCACTCAA GCTGGGCCTTCTCCCTCCACTGAGAACACCAGGGGACGAGCTGGCCCACTGGCCTGACCGCTGCACCGTGGGCCCTC CCTACCTGCAGCGTGGCACTCACAGCACTCACTCACTCGCCGACACAACTCTCTTCCAGGCTGTGACAAGGACCTGC TGATTGACATCCTGACCCAGCGCTGCAACACCCAGAGGCTGCTGATYGCCGAGGCTTACCTGGGTGCCTTCAGCCGG GTGAGCCCCCCAACCCCTCTCGTTTCCATGCGAACTTCTG 上述序列第275bp处的Y是C或T，该突变导致PCR-DpnI-RFLP多态性。2. -种检测权利要求1所述分子标记的PCR引物对，其特征在于，该引物对的序列如下 所示： 正向引物：GTCTGTAGCACCAGGAAAGGG， 反向引物：CAGAAGTTCGCATGGAAACG。3. -种筛选与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，其特征在于，所述的方法包括以 下步骤： 从绵羊湖羊全血中提取基因组DNA，在位于绵羊ANXA10基因突变位点附近设计一对引 物对，该引物对的序列如权利要求2所示，对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得 到如SEQIDNO: 2所示的序列，通过序列比对，筛查SNP，再利用权利要求2所示的引物对 进行PCR扩增，将PCR扩增获得的片段进行DpnI酶切分型及检测。4. 权利要求1所述的分子标记在绵羊免疫性状体外检测中的应用。5. 权利要求2所述的PCR引物对在绵羊免疫性状体外检测中的应用。
【专利摘要】本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及ANXA10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用。所述的分子标记由ANXA10基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ？ID？NO：2所述。在序列表SEQ？ID？NO：2的第275bp处有1个C275-T275的碱基替换，该突变导致Dpn？I-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增ANXA10基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为绵羊免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105368959
【申请号】CN201510933042
【发明人】王维民, 李发弟, 张小雪, 莫负涛, 喇永富, 李冲, 李宝胜
【申请人】甘肃中天羊业股份有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月15日