专利名称：一种与香味性状共分离的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与香味性状共分离的分子标记，属分子遗传学领域，专用于水稻 香味品种的选育与遗传研究，并可用于克隆香味基因。
背景技术：
香味是水稻重要的食味品质性状。许多优良的水稻品种具有令人愉快的香气，备 受消费者的欢迎，世界上每个水稻生产国或地区均有香稻种植。目前对香味的测定方法主要有咀嚼籽粒法、氢氧化钾法、高效液相色谱法，前两种 方法是通过嗅觉来进行的，咀嚼籽粒法大批量鉴定时会对舌头和鼻子造成影响，氢氧化钾 法对香味的释放也有一定的局限性，鉴定不准。高效液相色谱为香味的测定提供了客观的 方法，但该方法需要大批的样品量，而且费时(Jin et al.，2003)。在香稻选育方面，利用分子标记辅助选择可以准确、简单、快速地选育香稻。许多 研究者对香味基因的遗传分析和定位进行了研究，并为香稻育种提供了一些有用的分子标 记，但是目前所利用的分子标记距离较远，对香味不能准确鉴定。到目前为止，大部分研究表明稻米香味是受一个隐性单基因控制的。Ahnet al. (1992)利用一对近等基因系Lemont和香Lemont，香Lemont的香味基因来自供体 Delia,以有香味分离的F3群体为材料，通过RFLP分析表明，香味基因与位于第8染色体 上的RG28连锁，遗传距离为4.5cM。李欣等(1995)以籼型及粳型标记基因系为材料，分 别与武进香籼、武进香粳杂交，以碱浸法测定双亲和Fp F2、及部分F3组合的叶香，结果表明 香味基因与位于第8染色体上的标记基因v-8表现连锁，估算两者的重组值约为38. 03% ±3. 84%0 Jin etal. (1995)用 CT9993/KDML105 的 F2 分离群体为材料，找到一个 RAPD 引 物，这个引物只在非香群体中扩增到1.5kb片段，并表现与香味性状紧密连锁，用该引物 对两亲本、F2分离群体单株和其它不同品种进行分析，进一步证明了这种多态的可靠性。 Lorieux et al. (1996)以DH群体为材料，利用RFLP、RAPD、STS和同工酶标记及气相色 谱测定AcPy的浓度，证实了 AcPy是香味的主要成分，且香味基因与RG28相连锁，距离为 5. 8cM，同时鉴定出2个QTL，一个位于第4染色体，另一个位于第12染色体。Garland et al. (2000)根据RG28在一对香稻与非香稻品种之间的多态性区域发展了一个微卫星标记 S⑶-RICE-SSR-I，并选择附近区域的4个SSR标记对24个香稻和非香品种进行标记的多态 信息量分析，研究表明，S⑶-RICE-SSR-1、RM42和RM223可以用来区别不同品种中的香味 基因的复等位基因。Jin et al. (2003)找到了一个与香味基因连锁的SNP标记RSP04，用 RSP04对50个单株构成的F2分离群体进行基因型分析，发现RSP04与香味基因之间有两个 重组株，RSP04与香味基因相距2cM ；用RSP04对另外一个163个单株构成的F2分离群体进 行基因型分析，发现RSP04与香味基因之间有6个重组株，RSP04与香味基因相距约2cM。
3Dong etal. (2001)对三个日本当地香稻品种的三体遗传分析表明，这三个香稻品种的香味 是由一个隐性基因控制的，均属等位基因，位于第8染色体上。Siddiqet al. (1986)对一个 印度品种进行三体遗传分析，发现有两个隐性香味基因，分别位于第5和第9染色体。Chen 等(2006)把香味基因座定位在一个69kb的区间内。施军琼(2004)利用单片段代换系对 香味基因进行了初步定位，在两个分离群体中香味基因均与RM223共分离，在以Basmati 385为供体的分离群体中，香味基因距两侧标记RM515和RM284分别为2. 7cM和3. 3cM，在 以美国茉莉香为供体的分离群体中，香味基因距两侧标记冊515和RM210分别为2. 9cM和 11. 8cM。利用分子标记对水稻香味基因的分子标记辅助选择的技术国内外均有报道，但迄 今为止，关于水稻香味基因共分离的标记还未见报道，利用TPS溶液鉴定香味性状也是第 一次报道。我国香稻资源丰富，从不同的水稻品种中发掘、鉴定和定位香味基因，找到鉴定香 味性状准确可靠的方法，克服目前咀嚼法、KOH法和仪器分析法鉴定香味中不准的缺点，建 立共分离的香味基因分子标记，并利用与香味基因共分离的分子标记进行辅助育种，判断 香味基因是以杂合和纯合存在，能准确地选择在香味基因座上纯合和杂合的具有优异性状 单株，而且能够有目标地将香味基因在实验室选择得到，大大提高选择的效率。
发明内容
本发明的目的是克服现有鉴定水稻香味的方法的不足之处，而提供一种鉴定水稻 香味的方法，以及为分子标记进行辅助育种提供一种与香味性状共分离的分子标记，提高 选育效率。本发明该种鉴定水稻香味的方法如下(1)在分蘖期取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于-80°C冰箱中备用；(2)取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液 900 μ 1，75°C水浴 20 分钟；其中 TPS 溶液为=IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 0), IOmM EDTA (pH8. 0), IM KCl ；(3)打开盖，用鼻闻，即可判定香味的有无。本发明所提供的与香味性状共分离的分子标记，是由特异性PCR引物LOl上游端自5，-3，的核苷酸序列为CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5，-3，的核苷酸序列为GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特异性PCR引物L02上游端自5，_3，的核苷酸序列为 ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5，-3，的核苷酸序列为 CCAGACATAAATAATGGCATCTT经PCR扩增水稻基因组DNA得到的。其中引物LOl在香粳9407中扩增出280bp 的特异片段，在IRBB60中扩增出271bp的特异片段。引物L02在香粳9407中扩增出210bp 的特异片段，在IRBB60中扩增出200bp的特异片段。利用本发明提供的鉴定水稻香味的方法对曲阜香稻、明水香稻、香粳9407(均为 公知公用品种，国家种子库均有保存，可对外提供)分别和水稻品种IRBB60(公知公用品 种，国家种子库均有保存，可对外提供)杂交的F2分离群体进行香味性状鉴定。在分蘖期
4取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于_80°C冰箱中备用。取2-4cm长的水稻叶片放入1. 5ml 离心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μ 1，75°C水浴20分钟。打开盖，用鼻闻，可准确 判定香味的有无。TPS 溶液配方IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)，IOmM EDTA (pH8. 0)，IM KCl。此外本发明人设计出了 2对特异性的PCR引物，它能对水稻苗期香味性状进行标 记鉴定，检测是否具有香味基因fgr，其检测的准确性高，操作简单。由于曲阜香稻、明水香 稻、香粳9407是普遍应用的杂交品种的亲本，因此该分子标记还具有检测是否具有香味性 状的普遍意义，可以作为其他以香稻品种作为亲本育种材料的检测工具。本发明该种鉴定水稻香味的方法及与香味性状共分离的分子标记，具有以下优占.
^ \\\ ·(1)利用本发明鉴定水稻香味的方法(TPS法)鉴定水稻香味，简单易行，准确方 便。利用KOH法不能准确判定香味性状的单株，利用TPS法可准确判定。(2)标记稳定，不受环境影响。通过本发明设计的特异性PCR引物，2007年在不同 生育期取样，用这两标记进行检测，标记表现稳定，不受环境影响。(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。通过PCR标记的扩增，可以判定香味基因 是以纯合或杂合状态基因型存在的单株，加快香味性状分子标记辅助育种，大大提高选择 的效率。
图1 标记LOl对香粳9407X IRBB60杂交的F2代分子标记辅助选择电泳图谱M 为 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分离单株。图2 标记L02对香粳9407 X IRBB60杂交的F2代分子标记辅助选择电泳图谱M 为 Marker，P1，香粳 9407 ；P2, IRBB60 ；1-20, F2 分离单株。
具体实施例方式1、F2群体的创建和表型鉴定2005年利用曲阜香稻、明水香稻、香粳9407分别与IRBB60杂交，年底F1种子送海 南岛三亚加代，自交产生F2种子。2006年将F2分离群体播种于山东省水稻研究所实验农 场，5月1号播种，6月20号插秧，单株插植。插秧20天抽提F2分离群体的单株DNA，并利 用本发明鉴定水稻香味的方法(TPS法)鉴定水稻单株的香味性状，分有香味和无香味两种 表型，每个分离群体种植3000株，共9000株。2、F2分离群体的分子标记分析(1)用CTAB法提取曲阜香稻/IRBB60、明水香稻/IRBB60、香粳9407/IRBB60杂交 的F2各单株DNA。(2) SSR分析参照Panaud et al. (1996)的方法。20 μ 1 PCR反应体系为模板DNA IOng/μ 1,0. 15 μ 1 IOmM dNTPs，1· 5 个单位的 Taq 酶，2μ 1 10 X PCRbuffer (含 MgCl2)， 1. 5 μ 1的2uM正向和反向引物，反应体积20 μ 1。PCR反应程序为DNA 94°C预变性5min， 然后 94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，最后 72°C延伸 5min。在 PTC-200PCR 仪 上进行扩增，扩增产物在6%聚丙烯酰胺胶上进行分离电泳，银染参照李文涛等(2002)的 方法进行显色观察，记录实验结果。
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(3)水稻香味基因fgr已经被定位在水稻第8染色体RMl 109和PSM465之间(Chen et al. 2006，Fen, 2005)。在此基础上，利用RMl 109和PSM465对三个组合F2分离群体的 9000个单株进行扩增，在两个标记之间共筛选到106个交换株，利用本发明鉴定水稻香味 的方法(TPS法)鉴定水稻交换株的香味。同时根据所在区域日本晴和9311的基因组序 列，利用Primer Premier Version5设计PCR引物对LOl (上游端自5’ -3’的核苷酸序列 为 CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT，下游端自 5，-3，的核苷酸序列为 GTGTGCACTGGTCACTGTTTT)和 L02(上游端自5，-3，的核苷酸序列为ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT，下游端自5，-3，的核 苷酸序列为CCAGACATAAATAATGGCATCTT)，进行扩增。结果表明在曲阜香稻、明水香稻、香粳 9407和IRBB60之间LOl和L02表现多态性，其中在香粳9407和IRBB60的扩增结果如附 图1，2所示。通过分析交换株的基因型与香味表型，没有发现这两标记与香味基因fgr出 现交换，表现共分离。因此LOl和L02两标记可用于筛选香稻品种。
权利要求
一种与香味性状共分离的分子标记，其特征在于，是由特异性PCR引物L01上游端自5’ 3’的核苷酸序列为CCTTTGTGGTATTCCGTTGTT下游端自5’ 3’的核苷酸序列为GTGTGCACTGGTCACTGTTTT或特异性PCR引物L02上游端自5’ 3’的核苷酸序列为ATGTTTTAGTGTTTTTTCAGGCT下游端自5’ 3’的核苷酸序列为CCAGACATAAATAATGGCATCTT经PCR扩增水稻基因组DNA得到的。
全文摘要
本发明涉及一种与香味性状共分离的分子标记，属分子遗传学领域。在分蘖期取水稻单株上部1-2片幼叶，保存于-80℃冰箱中备用。取2-4cm长的水稻叶片放入1.5ml离心管中，放入液氮，研碎，加TPS溶液900μl，75℃水浴20分钟。打开盖，用鼻闻，可准确判定香味的有无。用特异性PCR引物L01或L02经PCR扩增即可得到该分子标记。本发明专用于水稻香味品种的选育与遗传研究，并可用于克隆香味基因。
文档编号C12N15/11GK101921761SQ20101028769
公开日2010年12月22日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者姚方印, 姜明松, 张晓东, 李广贤, 李润芳, 王文英 申请人:山东省水稻研究所