与小麦千粒重相关的基因、功能标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10、与该基因相关的分子标记TaSnTK2.10-4A-caps及该标记的应用。用TaSnTK2.10-4A-caps标记引物对待测小麦品种DNA进行PCR扩增，扩增产物用SalI内切酶进行酶切，将产物电泳分离，如PCR产物为793bp和316bp的两条带，则该小麦品种为具有该基因高千粒重单倍型的品种；如PCR产物只有一条大小为1106bp的带，则该小麦品种为不具有该基因高千粒重单倍型的品种。本发明所提供的小麦千粒重相关基因TaSnRK2.10及其分子标记，可以便于检测和筛选具有高千粒重的小麦品种或品系，可大大加快小麦高产品种的选育进程。
【专利说明】与小麦千粒重相关的基因、功能标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种与小麦千粒重相关的基因、分子标记及其应用
【背景技术】[0002]小麦是世界上最重要的粮食作物之一，因此选育高产小麦品种一直被育种家高度重视。研究证明，主要受籽粒大小性状影响的千粒重是最稳定的产量直接构成因素，小麦的千粒重每增加lg，每公顷小麦的产量将增加140-160kg(Tian et al.2006)。可见，提高小麦千粒重以增加产量是小麦最重要的育种目标之一。
[0003]功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来的一种新型分子标记，是来源于控制表型的基因序列内部，在鉴别基因序列的表型功能后，挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应，从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的DNA标记(Andersen J R and L bberstedt T 2003)。由于功能标记来自基因内的功能性基序，不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无，因此在作物遗传育种的研究应用中较传统分子标记更具高效、便捷等优势。
[0004]蔗糖非酵解型蛋白激酶是广泛存在于植物中的一类Ser/Thr类蛋白激酶，分为SnRKUSnRK2和SnRK3三个亚家族。其中SnRK2家族基因在植物脱落酸信号转导、渗透胁迫响应、气孔开闭、矿质营养吸收以及生长发育过程中具有重要作用(Anna et al.2011)。将小麦的SnRK2家族成员转化拟南芥进行功能研究，结果表明，该基因家族成员能显著提高转基因拟南芥的抗逆性，同时改善转基因植株的碳水化合物和能量代谢，调节植株生长发育和生量的积累(Mao et al.2010 ；Zhang et al.2010 ；Zhang et al.2011)。因此，SnRK2基因家族成员可能具有影响小麦千粒重，提闻小麦广量的潜在价值。目如，尚未有关于该基因家族成员影响小麦千粒重的研究报道。
[0005]因此，克隆与小麦千粒重相关基因SnRK2，开发相关的功能标记，进行单倍型分析，并与千粒重性状进行关联分析寻找优异的单倍型，对于提高小麦千粒重、获得高产小麦新品种具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10、与所述基因相关的功能标记开发及其应用，通过该功能标记对待测小麦品种或品系的DNA进行PCR扩增，可以快速筛选出具有较高千粒重的小麦材料。
[0007]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008]与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10，该基因包括TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.10-4B 和 TaSnRK2.10-4D ;其中所述 TaSnRK2.10-4A 的 cDNA 核苷酸序列如 SEQ IDNO: I所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述TaSnRK2.10-4B的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述TaSnRK2.10-4D的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0009]本发明克隆小麦千粒重相关基因TaSnRK2.10基因的步骤如下:
[0010]1、小麦TaSnRK2.10 cDNA序列电子克隆:(1)以NCBI提交的水稻SAPKlO (Accession:AB125311)基因序列为探针，搜索小麦EST数据库，将得到的序列用DNAMAN软件拼接，对开放阅读框进行预测，以获取完整的小麦SnRK2.1OcDNA序列；(2)根据得到的全长cDNA序列用Primer5软件设计并筛选出两对特异引物SnRK2.10-1和SnRK2.10-2，分别用于小麦SnRK2.1OcDNA和gDNA基因克隆。
[0011]2、利用Trizol试剂盒法提取总RNA: (I)磨碎叶片；(2)将磨碎的叶片加入到盛有Trizol试剂的离心管中，混匀，放置片刻；(3)在4°C下离心，取上清，加入到一个新的无RNase的离心管中；(4)在新的离心管中加入氯仿，震荡，放置后，再离心；(5)取上层水相至，在水相中加入0.5倍体积的无水乙醇，将得到的溶液转移到吸附柱中，离心lmin，弃废液；(6)向吸附柱中加入500 μ I去蛋白液RD，离心lmin，弃废液；(7)向吸附柱中加入漂洗液RW，静置后，离心，弃废液；重复一次。(8)将吸附柱离心，去掉残余液体，将吸附柱晾干；
(9)将吸附柱转入一个新的离心管中，加入RNase-free ddH20，室温后，离心，得到的液体即为 RNA。
[0012]3、利用改良CTAB法提取DNA: (I)将叶片磨成细粉；(2)加入CTAB提取液，震荡温育；(3)置于低温下加入酚和氯仿，离心；(4)取上清液，加入氯仿-异戊醇混匀，离心20 ；
(5)取上清液，加入冰异丙醇，混匀，带核酸沉淀出现，离心；(6)弃上清液，用乙醇洗涤沉淀两次；(7 )弃乙醇，吹干DNA，用250 μ I IX TE溶解DNA，加入RNase，水浴去除RNA，即得DNA ；
`[0013]4、利用反转录试剂盒进行第一链cDNA序列合成:在离心管中加入总RNA、oligodT引物(50 μ Μ)、dNTP混合物，将样品置于65°C 5min用于打开RNA的二级结构，迅速冷却，瞬时离心后加入5x反应缓冲液，RNA酶抑制剂，反转录酶，无RNA酶ddH20，混匀，待反应终止，稀释后保存于冰箱备用；
[0014]5、聚合酶链式反应(PCR)反应进行序列扩增:用TaSnRK2.10-1和TaSnRK2.10-2引物分别对小麦cDNA和gDNA进行PCR扩增，将扩增产物保存；
[0015]6、PCR产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收:(I)柱平衡；(2)将单一的目的DNA条带切下置于离心管中，称重；(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC，水浴放置片刻，使之充分溶解；(4)将所得溶液加入吸附柱CB2中，将吸附柱CB2放入收集管中；(5)向吸附柱CB2中加入漂洗液PW，将吸附柱CB2放入收集管中；(6)重复操作步骤5 ; (7)将吸附柱CB2放入收集管中，离心，除去漂洗液；将吸附柱晾干；(8)将吸附柱CB2放入离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温离心，收集DNA溶液。
[0016]7、基因克隆:取4PCR回收产物加入与pEASY-Tl载体，混合，室温反应，完成连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，在表面涂有IPTG，X-gal的氨苄青霉素LB平板生长过夜；挑选白色菌落，通过快速PCR挑选阳性克隆测序；
[0017]8、小麦 TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.10-4B 和 TaSnRK2.10-4D 序列分析:(I)运用SnRK2.10-1和SnRK2.10-2引物进行PCR扩增，分别得到3条全长cDNA序列和对应的gDNA序列，根据序列差异设计基因组特异引物，TaSnRK2.10-4A1、TaSnRK2.10-4B1和TaSnRK2.10-4D1扩增中国春缺四体DNA进行染色体定位，3条序列分别定位在4A、4B和4D基因组上；(2)运用DNAman软件对测序结果进行分析，以SnRK2.10-1引物扩增的小麦TaSnRK2.10-4A 的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示，分子量为 1339bp、TaSnRK2.10-4B 的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，分子量为1342bp、以及TaSnRK2.10-4D的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，分子量为1284bp ;分别包含一个长为1086bp的开放阅读框，编码361个氨基酸；以引物SnRK2.10-2扩增的TaSnRK2.10-4A的gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其分子量为2080bp、TaSnRK2.10-4B的gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其分子量为2007bp和TaSnRK2.10-4D的gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，其分子量为2029bp，分别包含8个外显子和7个内含子；(3)检测小麦TaSnRK2.10_4A、TaSnRK2.10-4B和TaSnRK2.10-4D和水稻氨基酸同源性，得知小麦的TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.10-4B和TaSnRK2.10-4D与水稻SAPKlO氨基酸序列具有很高的同源性，氨基酸序列一致性达到95%以上，该基因是小麦千粒重的功能基因。
[0018]本发明扩增所述TaSnRK2.10基因所设计的引物为TaSnRK2.10-1和TaSnRK2.10-2 ；
[0019]采用弓I 物 TaSnRK2.10-1
[0020]正向引物序列GCTTGCTCGGTTGCTTTGC (如 SEQ ID NO:7 所述)，
[0021]反向引物序列CATCCAAAAGGCCAAACCGT (如 SEQ ID NO:8 所示)；
[0022]采用TaSnR K2.10-2 引物
[0023]正向引物序列GTCAAGTACATCGAGCGAGGG (如 SEQ ID NO:9 所述)，
[0024]反向引物序列CGTCGTTCAGGAACTGGTTGA (如 SEQ ID NO: 10 所述)。
[0025]本发明用于所述TaSnRK2.10基因染色体定位的引物为TaSnRK2.10-4A1，TaSnRK2.10-4B1和 TaSnRK2.10-4D1 ；
[0026]所述引物TaSnRK2.10-4A1 的
[0027]正向引物序列CTTCATTCGCAACCAAAATCTACG (如 SEQ ID NO:11 所述)，
[0028]反向引物序列GAACTGGTTGATCCGAGAACGG (如 SEQ ID NO:12 所示)；
[0029]所述引物TaSnRK2.10-4B1 的
[0030]正向引物序列TGCTTGCTTCACTGTCGCAG (如 SEQ ID N0:13 所述)，
[0031]反向引物序列GCAGAGTCTAGCAGTACCGTT (如 SEQ ID NO:14 所述)；
[0032]所述TaSnRK2.10-4D1 的
[0033]正向引物序列CCATGACGTTCTCCGTTCCC (如 SEQ ID N0:15 所述)，
[0034]反向引物序列GCACACTCAATATCCTCTGGC (如 SEQ ID NO: 16 所述)。
[0035]本发明该分子标记为TaSnRK2.10-4A_caps,其所述分子标记的引物
[0036]正向引物序列CTTCATTCGCAACCAAAATCTACG (如 SEQ ID NO: 11)所述，
[0037]反向引物序列GAACTGGTTGATCCGAGAACGG (如 SEQ ID N0:12)所述。
[0038]一种利用分子标记TaSnRK2.10-4A_caps检测小麦品种千粒重的方法，包括以下步骤:
[0039]a.用TaSnTK2.10-4A_caps的标记引物对小麦品种的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20μ 1，包含Η2014.3μ 1，2XPCR缓冲液2.0μ 1，Taq酶0.20μ 1，左反向引物各 0.5 μ 1，cDNAl.0 μ 1，dNTP 1.5 μ I ;扩增条件为 94°C 预变性 4min ;94°C 变性 40s, 58 °C退火45s，72°C延伸lmin，35个循环；72°C延伸IOmin ;10°C保存。[0040]b.将上述扩增产物分别用Sal I内切酶进行酶切，酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，如PCR扩增产物被切开大小为793bp和316bp的两条带，则该小麦品种属于具有高千粒重纯合体品种；如PCR产物被切开为793bp和316bp的带，同时具有未切开的1106bp大小的带，则该小麦品种属于具有高千粒重的单倍型的杂合体品种；如PCR扩增产物只有一条未切开的大小为1106bp的带，则该小麦品种属于不具有高千粒重的纯合体品种；其中SalI内切酶体系为20 μ 1，包含SalI内切酶I μ 1，IOX缓冲液2 μ 1，PCP产物17 μ I ;反应条件为 37°C，5min。
[0041]本发明首次克隆了一个与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10，该基因在不同的小麦品种中存在紧密连锁的3个SNP位点和一个InDel位点，表现为两种单倍型，将单倍型与千粒重性状进行关联分析，发现两种单倍型与小麦千粒重显著相关；基于上述，本发明还开发一个与千粒重相关的功能标记TaSnRK2.10-4A_caps,通过该分子标记对小麦DNA进行PCR扩增，可以快速检测和筛选出具有较高千粒重的小麦品种或品系。
[0042]本发明提供了与小麦千粒重相关的基因TaSnTK2.10，基于该基因开发的分子标记应用于小麦育种，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提闻了闻广小麦品种或品系的选择效率和质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1 为小麦 TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.1-04B 和 TaSnRK2.10-4D 与水稻 SAPKlO 的
氨基酸序列比较。
[0044]图2为TaSnRK2.10基因利用中国春缺体-四体的定位结果。01:山农0431 ；02:鲁麦 21 ；03:N4AT4B ；04:N4BT4A ；05:N4DT4B ；06:水。
[0045]图3为开发SNP marker不意图。M:marker ;01:鲁麦21号；02:中国春；03:烟农15号；04:济南17号；05:小偃81 ；06:济宁17号；07:山农0431 ；08:山农8355 ；09:鲁麦23号；10:潍麦8号。
[0046]图4为利用TaSnRK2.10-4A_caps标记检测以小麦品系山农0431为亲本的F7代RIL群体的13个衍生品系的结果。
【具体实施方式】
[0047]以下结合实例，对本发明进行详细说明:
[0048]实施例1
[0049]小麦千粒重相关基因TaSnRK2.10基因克隆，使用的材料为鲁麦21。
[0050]1)小麦TaSnRK2.1OcDNA序列电子克隆；
[0051](1)以从^1提交的水稻5么?1(10(4(^688丨011^8125311)基因序列为探针，搜索小麦EST数据库，将得到的序列用DNAMAN软件拼接，对开放阅读框进行预测，以获取完整的小麦SnRK2.1OcDNA 序列。
[0052](2 )根据得到的全长cDNA序列用Pr imer5软件设计并筛选出两对特异引物SnRK2.10-1 和 SnRK2.10_2，分别用于小麦 SnRK2.1OcDNA 和 gDNA 基因克隆。
[0053]TaSnRK2.10-1 正向引物:5' -GCTTGCTCGGTTGCTTTGC-3' (SEQ ID NO:7)
[0054]反向引物:5'-CATCCAAAAGGCCAAACCGT-3' (SEQ ID NO:8)[0055]TaSnRK2.10-2 正向引物:5' -GTCAAGTACATCGAGCGAGGG-3' (SEQ ID NO:9)
[0056]反向引物:5'-CGTCGTTCAGGAACTGGTTGA-3' (SEQ ID NO:10)
[0057]2)利用Trizol试剂盒法提取总RNA，具体步骤如下:
[0058](I)在冷却的研钵中加入液氮，取0.1g叶片放入液氮中，用研磨棒磨碎；(2)取1.5ml离心管，加入Iml Trizol试剂，将磨碎的样品加入到该离心管中，充分混匀，放置5min左右；(3)将离心管在4°C，12000rpm离心机中离心5min，取上清，加入到一个新的无RNase的离心管中；(4)在新的离心管中加入200 μ I氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min，4°C, 12000rpm离心IOmin ; (5)取上层水相至新的1.5ml离心管中，缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，将得到的溶液转移到吸附柱中，4°C，12000rpm离心lmin，弃废液；(6)向吸附柱中加入500 μ I去蛋白液RD，4°C，12000rpm离心lmin，弃废液；(7)向吸附柱中加入600 μ I漂洗液RW，室温条件下静置2min，4°C，12000rpm，离心lmin，弃废液。重复该操作一次；(8)将吸附柱4°C, 12000rpm,离心2min,去掉残余液体,将吸附柱晾干(室温IOmin左右即可)；
(9)将吸附柱转入一个新的离心管中，加入50μ I RNase-free ddH20，室温放置2min，4°C，12000rpm离心2min，得到的液体即为RNA，保存于_80°C冰箱中。
[0059]3 )利用改良CTAB法提取DNA，具体步骤如下:
[0060](I)取0.15~0.2g新鲜叶片放入2ml离心管中，迅速放入液氮中至少IOs,快速磨成细粉；(2)加入Iml已预热至65°C的CTAB提取液，65°C温育lh，每20min颠倒混匀离心管或者轻微震荡温育；(3)置于4°C冰箱或室温冷却至15°C以下，加入Iml温度4°C的按体积比为1:1的酹和氯仿，上下混匀30min,然后1000rpm离心20min ; (4)取700 μ I上清液，加入等体积的体积比为24:1的氯仿-异戊醇，上下混匀30min，保证样品与氯仿充分混和，1000Orpm离心20min ； (5)取上清液500 μ I,加入等体积的冰异丙醇,轻轻上下颠倒管子15次,可以看到核酸沉淀，1000Orpm离心30min ； (6)弃上清液，lml70%的乙醇洗漆沉淀两次；
[0061](7)弃乙醇，吹干 DNA，用 250 μ I I X TE 溶解 DNA，加入 1.0 μ I 2mg/ml 的 RNase，37°C水浴30min去除RNA，即得到所需DNA。
[0062]4)利用反转录试剂盒进行第一链cDNA序列合成
[0063]在0.5ml离心管中加入总RNA8 μ 1，oligo dT引物(50 μ M) I μ I，dNTP混合物(每种dNTP10mM)ly 1，将样品置于65°C 5min用于打开RNA的二级结构，然后迅速置于冰上211^11，瞬时离心后加入51反应缓冲液4.(^1，RNA酶抑制剂(40U/μ I) 0.5 μ 1，反转录酶(200U/ μ I) 1.0 μ 1，无 RNA 酶 ddH204.5 μ I，轻轻混匀，42°C 反应 70min，95°C处理 5min 终止反应，稀释至200 μ I保存于-20°C冰箱备用。
[0064]5)聚合酶链式反应(PCR)反应进行序列扩增
[0065]用TaSnRK2.10-1 和 TaSnRK2.10-2 引物分别对小麦 cDNA 和 gDNA 进行 PCR 扩增，其PCR扩增体系为20 μ 1，包含ddH20 14.3μ 1，2XPCR缓冲液2.0 μ 1，Taq酶(5U/μ 1)0.20 μ 1，左反向引物各0.5μ 1，稀释后的cDNAl.0y 1，(1ΝΤΡ1.5μ I ;扩增条件为94 °C预变性 4min ;94°C变性 40s，58°C退火45s，72°C延伸 2min，35 个循环；72°C延伸 IOmin ；10°C
保存；
[0066]6) PCR产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收，具体步骤如下:
[0067](I)柱平衡步骤:向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ I平衡液BL，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量；(3)向胶块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0.lg，其体积可视为100 μ 1，则加入100 μ I PC溶液)，50°C水浴放置IOmin左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
[0068](4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；(5)向吸附柱CB2中加入600 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；(6)重复操作步骤5 ; (7)将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干；
[0069](8)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
[0070]7)基因克隆:取4 μ I PCR回收产物加入与I μ I pEASY-Tl载体，轻轻混合，室温(200C -370C )反应5分钟，完成连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面涂有8μ I IPTG (500mM),40y I X_gal的氨苄青霉素(100 μ g/ml) LB平板生长过夜；挑选白色菌落，通过快速PCR挑选阳性克隆测序。
[0071]8)小麦 TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.10-4B 和 TaSnRK2.10-4D 序列分析。
[0072](I)运用SnRK2.10-1和SnRK2.10_2引物进行PCR扩增，分别得到3条全长cDNA序列和对应的gDNA序列，根据序列差异设计基因组特异引物，TaSnRK2.10-4A1、TaSnRK2.10-4B1和TaSnRK2.10-4D1扩增中国春缺四体DNA进行染色体定位，3条序列分别定位在4A、4B和4D基因组上。
[0073]TaSnRK2.10-4A`1 正向引物:CTTCATTCGCAACCAAAATCTACG (SEQ ID NO:11)
[0074]反向引物:GAACTGGTTGATCCGAGAACGG(SEQ ID NO:12)
[0075]TaSnRK2.10-4B1 正向引物:TGCTTGCTTCACTGTCGCAG (SEQ ID NO:13)
[0076]反向引物:GCAGAGTCTAGCAGTACCGTT(SEQ ID NO:14)
[0077]TaSnRK2.10-4D1 正向引物:CCATGACGTTCTCCGTTCCC (SEQ ID NO:15)
[0078]反向引物:GCACACTCAATATCCTCTGGC(SEQ ID NO:16)
[0079](2 )运用DNAman软件对测序结果进行分析，以SnRK2.10-1引物扩增的小麦TaSnRK2.10-4A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、TaSnRK2.10-4B的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示以及TaSnRK2.10-4D的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；其cDNA序列全长分别为1339、1342和1284bp，分别包含一个长为1086bp的开放阅读框，编码361个氨基酸。以引物 SnRK2.10-2 扩增的 TaSnRK2.10-4A 核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示、TaSnRK2.10-4B的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示和TaSnRK2.10-4D核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；其gDNA序列全长2080、2007和2029bp，分别包含8个外显子和7个内含子。
[0080](3)检测小麦 TaSnRK2.10_4A、TaSnRK2.10-4B 和 TaSnRK2.10-4D 和水稻氨基酸同源性检测。小麦TaSnRK2.10-4A的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示、TaSnRK2.10-4B的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示、TaSnRK2.10-4D的氨基酸序列SEQ ID NO:19所示。经DNAman 软件序列比对得知小麦的 TaSnRK2.10-4A、TaSnRK2.10-4B 和 TaSnRK2.10-4D 与水稻SAPKlO氨基酸序列具有很高的同源性，氨基酸序列一致性达到95%以上，该基因是小麦千粒重的功能基因。其结果见图1。N端氨基酸含有ATP结合位点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点；同时C端富含谷氨酸，与蛋白质的相互作用有关，属于蛋白激酶基因家族。
[0081]实施例2
[0082]功能标记开发与关联分析
[0083]I)用TaSnRK2.10-2 (正向引物序列为SEQ ID NO:9，反向引物序列为SEQ ID NO:10)引物序列对黄淮麦区10份材料DNA进行PCR扩增并分析基因组序列发现TaSnRK_4A(SEQ ID NO:4)序列在品种间存在SNP和InDel序列差异。
[0084]2)在TaSnRK2.10-4A基因组序列中存在3个SNP位点和一个InDel位点，如图3a所示:自5’端第1123位核苷酸为C或T，自5’端第1321位核苷酸为A或T，自5’端第1757位核苷酸为G或C，自5’端第1832-1834位核苷酸为TGA三核苷酸的缺失或者插入。三个SNP位点和一个InDel位点紧密连锁:当自5’端第1123位核苷酸为C时，自5’端第1321位和第1757位核苷酸为一定为A和G，同时第1832-1834位核苷酸为TGA三核苷酸的缺失；当自5’端第1123位核苷酸为T时，自5’端第1321位和第1757位核苷酸为一定为T和C，同时第1832-1834位核苷酸为TGA三核苷酸的插入。由此形成两种单倍型CAG_delete和TTC-1nsert,分别命名为 HAP-4A-H 和 Hap_4A_L。
[0085]3)自5’端第1757位的SNP位点在两种单倍型中周围的核苷酸序列(1756-1766bp)为:
[0086]Hap-4A-H5' -CGAGTGTCGACATCTTATCG-3' [0087]Hap-4A-L5' -CGAGTGTCGAGATCTTATCG-3'
[0088]此SNP位点在两种单倍型中的差异产生一个SalI酶切位点(GTCGAC)多态性，其中Hap-4A-H单倍型在此SNP位点的核苷酸为C，能被SalI内切酶识别并切开，Hap-4A_L单倍型在此SNP位点的核苷酸为G，不能被SalI内切酶识别。根据此处的SNP位点开发基因组特异的SNP标记，命名为TaSnTK2.10-4A_caps (正向引物序列为:SEQ ID N0:11，反向引物序列为SEQ ID NO:12)。
[0089]4)用TaSnTK2.10-4A_caps对已测序的10份小麦材料进行PCR扩增，PCR产物分别经SalI酶切后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，如图3c所示，验证SNP标记的准确性:其PCR扩增体系为20 μ I，包含Η2014.3 μ I，2 X PCR缓冲液2.0 μ I，Taq酶0.20 μ I，左反向引物各0.5 μ 1，cDNAl.0 μ I, dNTPl.5μ I ;扩增条件为 94°C预变性 4min ;94°C变性 40s，55°C退火45s，72。。延伸lmin，35个循环;72°C延伸IOmin ;10°C保存。Sail内切酶体系为20 μ 1，包含Sail内切酶1μ 1，10X缓冲液2μ 1，PCP产物17μ I ;反应条件为37°C，5min。PCR产物酶切后电泳，结果表明，Hap-4A-H单倍型的5份材料其PCR产物被切开大小为793bp和316bp的两条带；Hap-4A-L单倍型的5份材料其PCR产物只有一条大小为1106bp的带，基于此标记的单倍型分析结果与测序分析单倍型的结果相一致。
[0090]5)将128份材料组成的品种群体进行了两年共三个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考查不同年份和不同环境条件下的各个品种千粒重，其中两年三个试验环境即2011年泰安、2012年泰安和2012年烟台。
[0091]其中小麦种植方法:每个品种种植5行，行长2m、行间距25cm、每行种植70粒种子，正常生长及收获；千粒重测定方法:将收获后各株系的小麦种子取500粒称重，重复3次，取平均值计算千粒重，结果见表1。
[0092]表1 128个小麦品种的单倍型和千粒重性状[0093]
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1山农 21.屮U山东Hap4A-L47.4343.7045.3045.48
2954(7)-8屮_丨丨东HapAA-L54.0043.4750.2049.22
3烟农丨5 号中_丨丨<*、_-4A-L38.7337.3036.7637^0
4鲁老 21 矸屮 W 山东Hap-4A-L53.3046.5045.2048.33
5济纪》9兮中 ^山^Hap-4A-L48.0744.4051,4347,97
6济南丨7 号中W山东Hap-4A-L44JO37.7740.5740.81
7烟农 19 号屮U 山东Hap-4/VL52.4342.1546.0046.86
8uIk 23 ^中 M 山东Hap-4A-H62.7356.9052.9957.54
9泰山 21 号十W山东Hap-4A-H55.6048.2351.835L89 K)鲁麦 22 号屮 W 山东Hap-4,\_H55.1756.5352.2?54.66 11淄灰丨2?中国山 €Hap-4A-L50.9745.0049,2448,40 1.2潍麦8 号十W山东Hajv4A-H57.1355.6754.0?55.62
13济衣 21 V中同山:4:Hap-4A-L54.7347.8?48.5750.39
14济宁 i6 ^中M 山东Hap-4A-H59.2052.1755.4355.60
15泰山 23 号lIiW山东_-4A-L56.4347.8047.1750.47
16山农 664中 W 山Hap4/VH54.7352.5048.7351.99
17潍犮 7?'中 M山 4;Hap-4A-L50.0339.8046,4745.43
18—策州 95021屮 W丨丨丨东Hap-4A-L53.9037.5045.7045.70
19烟农 23?'中 W 山东Hap-4A-L51.1038,1741.0343.43
20烟农 22 号巾 M 山 4、Hap-4A-H52.7739.7744.3545.63
21山融 3 >/lIiPl 山东Hap-4A-H58.5355.7048.9054.38
22山农 12中 W 山Hap-4A-H56.8349.3055.4353.86
23尜山 22 号中 W 山 IHap-4A-L5X3?46.4049.3351.37
24ftM 99 山 gHap-4/\-L61.4746.7751.5753.27
25烟农 21 兮中 M 山东Hap-4A-L54.2042.8046.1147.70
26丨Il农《355中 W 山 1、Hap-4A-H62.5755.8359.3059—23
27汶农 5 '?巾 P!山东Hap-4A-L51.9042.7044.5046.3?
28济宁 17 号中|句山&Hap-4A-H63.2056.6359.5359.79
29泰山 24 4屮围山厶ilap-4A-L49.8345.1345.5346.83
30MhM 4中 _山￥Hap-4A-H55.6350.4347.7051,26
31济友 22?.中 M 山东Hap-4A-L53.5043.9351.5349.66
32汶农 6 '4屮 BI山 tHap-4A-L52.3048.4344.7048.48
33山农 15中 Pl 山东Hap4A-L56.0751.3054.4153.92
34山农 23中 M 山Hap-4A-L51.8047.3349.3349.49
35￥iQ 9 flIi国丨丨丨东Hap4A-L45.2738.8042.7042.26
36it 289巾同山包H51,7045.875t).2049,26
37山农 18屮[I I丨丨东Hap-4A-L49.5744.3044.9346.27
38鄭犮 98屮_山东Hap-4A-H54.3050.6749.0051.32
39山农 17巾 W山iiHap4/VL49.6741.9043.3944.99
40齐 Τ-1'.?屮 Bh 丨丨东Hap-1A-H56.8246.4046.1049.77
41烟农 83ft小网山 4;Hap4A-H55.7745.3350.5750.56
42烟农 0428中 M 山 ￥Hap-4A-L52.1340.4042.1044M
43烟农 9卿屮国丨丨丨东Hap-4/\-H63.2047.7054.2755.06
44科农 IW屮_河北Hap-4A-H55.0045.5?44.6748.41
45_石 4185_屮 IJl 河北Hap-4A-L51.73_39.63_40.1343.83 [0094]
【权利要求】
1.与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10,其特征在于，该基因包括TaSnRK2.10-4A、TaSnMZ 10~4^> 和 TaSnRK2.10-4D ;其中所述 TaSnRK2.10-4A 的 cDNA 核苷酸序列如 SEQ IDNO: I所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述TaSnRK2.10-4B的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述TaSnRK2.10-4D的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示、gDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10，其特征是在于，扩增 TaSnRK2.10 基因的引物为 TaSnRK2.10-1 和 TaSnRK2.10-2 ;其中 TaSnRK2.10-1 的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；TaSnRK2.10-2的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10 所示。
3.根据权利要求1所述的与小麦千粒重相关的基因10，其特征在于，用于TaSnRK2.20基因染色体定位的引物为TaSnRK2.10-4A1, TaSnMZ 10-4B1和TaSnRK2.10-4D1 ；其中TaSnRK2.10-4A1的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示，TkSAU.20-游7的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示，TaSnRK2.10-4D1饱正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示、反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所/Jn ο
4.一种与小麦千粒重相关的基因TaSnRK2.10的分子标记,其特征在于,该分子标记为TaSnRK2.20-办-ca/zs，其分子标记的引物正向核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示、反向核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
5.一种利用分子标记TaSnRK2.10-4A-caps检测小麦品种千粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤: a.用TaSnTK2.10-4A~caps的标记引物对小麦品种的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μ?，包含H2O 14.3 `μ 1，2XPCR缓冲液2.0 μ?，Taq酶0.20 μ?，左反向引物各 0.5 μ I, cDNA 1.0 μ I, dNTP 1.5 μ I ;扩增条件为 94°C预变性 4 min ;94°C变性 40s，58°C退火 45 s，72°C延伸 I min，35 个循环；72°C延伸 10 min ;10°C保存； b.将上述扩增产物分别用SalI内切酶进行酶切，酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳分离，如PCR扩增产物被切开大小为793 bp和316 bp的两条带，则该小麦品种属于具有高千粒重纯合体品种；如PCR产物被切开为793 bp和316 bp的带，同时具有未切开的1106bp大小的带，则该小麦品种属于具有高千粒重的单倍型的杂合体品种；如PCR扩增产物只有一条未切开的大小为1106 bp的带，则该小麦品种属于不具有高千粒重的纯合体品种；其中SalI内切酶体系为20 μ 1，包含SalI内切酶I μ 1，IOX缓冲液2 μ 1，PCP产物17μ I ;反应条件为37°C，5 min。
【文档编号】C12N15/11GK103820476SQ201410033076
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】李斯深, 张照贵, 赵岩, 孔凡美, 郭营 申请人:山东农业大学