一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因和应用。一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码该小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供了一种新的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122及其编码基因。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmh122编码基因转入小麦中，可以提高小麦的千粒重。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。
【专利说明】-种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上最主要的粮食作物之一，其提供的热量占人类所需总热量的17%以 上（Khush et al. 2003)，养活了大约40%的全球人口（Gupta et al. 2008)。不断提高小麦 产量是世界范围内小麦育种的最基本目标。
[0003] 富含脯氨酸的蛋白质（proline - rich proteins, PRPs)代表一类富含 proline (Pro -)和hydroxyproline (Hyp -)的结构蛋白，这类蛋白质在双子叶植物如大豆、 胡萝卜和紫花苜蓿及单子叶植物如玉米和小麦等植物中广泛存在，研究显示，它们在很多 植物中表达，参与植物发育的不同方面.例如，种子发育，豆荚形成，早期结瘤等.PRPs基因 的表达还受伤害、真菌、乙烯、细胞培养、干旱和光照影响，富脯氨酸类蛋白种类繁多，结构 的多样性决定了功能的多样性，但对于它们的确切功能知之甚少，富脯氨酸类蛋白在种子 发育过程中的功能还未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小麦富脯氨酸类蛋白 Tazmhl22〇
[0005] 本发明的另一目的是提供该小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的编码基因。
[0006] 本发明的又一目的是提供编码基因的应用。
[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0008] 一种小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22,氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。该蛋白包 含173个氨基酸，等电点为4. 86,脯氨酸占35. 3%。在NCBI网站上进行序列比对没有发现 与该多肽链具有同源性蛋白序列公布，因此麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22是一类新的富脯 氨酸类蛋白。
[0009] 编码所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的基因。
[0010] 所述的编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的基因，优选核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所示。
[0011] 含有小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22编码基因的重组表达载体。
[0012] 所述的重组表达载体，优选出发载体为任何一种可以引导外源基因在植物中超量 表达的载体。
[0013] 所述的重组表达载体，进一步优选将所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22编码 基因插入PBI121表达载体PstI酶切位点所得。
[0014] 本发明所述的编码小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的基因在品种改良中的应用； 优选所述的基因在提1?小麦千粒重中的应用。
[0015] 本发明所述的重组表达载体在品种改良中的应用；优选在提高小麦千粒重中的应 用。
[0016] 利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的富 脯氨酸类基因 Tazmhl22导入植物细胞，可获得改变植物千粒重的转基因细胞系及转基因 植株。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗 生素标记基因（如：潮霉素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转 化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于 快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外 源基因之间加入报告基因（GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因），构建报告基因和外 源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达 量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载 体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的Tazmhl22表达载体 可通过使用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物 病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。 被转化的植株材料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如：水稻、棉花、小麦、大豆、 烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。
[0017] 有益效果：
[0018] 本发明提供了一种新的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22及其编码基因。通过基因 工程的方法将本发明提供的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22编码基因转入小麦中，可以提 高小麦的千粒重。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表 达不会影响植物的食品安全性，可在作物育种中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1转基因小麦的PCR检测。
[0020] 其中B、C、D、E为不同的转基因株系，Bobwhite表不进彳丁转基因实验时的受体材 料，为进行小麦遗传转化的常用基因型，阳性对照为携带有小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22 编码基因的表达载体。
【具体实施方式】
[0021] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
[0022] 实施例lTazmhl22蛋白的获得。
[0023] 记录小麦品种望水白每穗小花开花时间，取开花后3天，10天的种子，取材后立即 用液氮冷冻。取700mg冻存的种子，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯 醋酸/丙酮振荡混匀、-20°C沉淀1小时；4°C 15, OOOg离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷 丙酮中，-201：放置2小时；41：15,00(^离心151^11，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，-201： 放置1小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入IOyL裂解液（7M脲，2M硫 脲，4%CHAPS，1%CA，0. 3%蛋白酶抑制剂，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C搅拌抽提 15min后加入14mM的DTT ;4°C再搅拌20min，然后35, OOOg离心lOmin，上清即为蛋白抽提 液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS -PAGE电泳。电泳缓冲液用Tris -Glycine -SDS 缓冲液，温度设为17°C ;先用2. 5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板 下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进行银染。取一个分子量为18. 045千道尔顿，等电点为 4. 86的蛋白点即为Tazmhl22蛋白。
[0024] 实施例2 :编码Tazmhl22蛋白的cDNA序列的获得。
[0025] 对实施例1得到的蛋白点进行质谱分析获得其氨基酸组成信息，根据对应肽 片段的EST用来搜索小麦EST数据库，得到了 4条EST序列：BM135088. 1，BJ250155. 1， CN007768. 1和BJ244353. 1，将上述4条EST序列进行拼接，然后用MacVector软件设 计引物 Pl，Pl 引物对如下：F-5' -ATGGCGGGTGGCAAAGCCGCTCTGC-3'（SEQ ID NO. 3) ;R : 5'-CTAGACATTGGGCTTGTAGGCAGGC-3'（SEQ ID NO. 4)。以望水白开花后 3 天的种子 cDNA 作 为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦种子的总RNA，采用Promega公司的反转录 试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。用引物Pl进行PCR扩增，扩增体系为25 μ L，包括5ng 模板，F 和 R 引物各 5pmol，dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgC12, 0· 5 单位的 DNA聚合酶，lx PCR缓冲液。扩增的程序是：94°C变性3分钟；30个循环，94°C变性20秒， 51°C退火30秒，72 °C延伸1分钟；最后72 °C延伸5分钟。通过PCR扩增，获得了包含开放读 码框的522bp的核苷酸序列，将该核苷酸与T-载体在16°C连接30min，连接体系为10 μ L， 包括T-载体1 μ L，PCR产物4 μ L，连接酶1 μ L，连接酶缓冲液1 μ L，ddH203 μ L。连接产物 通过42°C热击40秒，转化到大肠杆菌细胞中，送至华大基因公司测序，所得序列如SEQ ID NO :1所示。该序列编码173个氨基酸，如SEQ ID NO :2所示，等电点为4. 86。
[0026] 实施例3 :转Tazmhl22基因小麦的千粒重得到提高。
[0027] 以望水白开花后3天的种子cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2引物 对如下：F-5' -GTACCTGCAGATGAAGATGGGCCCGT-3'（SEQ ID N0.5);R-5' -TGCACTGCAGTCA AACCCCAAGTTTG-3'（SEQ ID NO. 6)。将扩增得到的PCR产物用限制性内切酶PstI进行酶 切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的PBI121表达载体进行连接，获得由CaMV35S启 动子启动的TaJRL2超量表达的质粒载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5 α大肠杆 菌菌株中，通过含有50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993 年Weeks发表在Plant Physiol第102期1077 -1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚 短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将Actin 启动子控制下的Tazmhl22基因导入小麦材料Bobwhite中，将基因枪转化后的愈伤放置于 含有30mg/L G418的1/2MS培养基上进行筛选，剪取获得的再生苗叶片，提取DNA进行PCR 检测，获得Tazmhl22超量表达的转基因小麦。统计T3代转基因小麦和非转基因小麦千粒 重数据。结果表明，以未进行转化的小麦材料Bobwhite为对照，转基因植株千粒重得到提 高（表1)。
[0028] 表 1
【权利要求】
1. 一种小麦富脯氨酸类蛋白1&观1!122，其特征在于氨基酸序列如3￡〇10勵：2所示。
2. 编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的基因。
3. 根据权利要求2所述的编码权利要求1所述的小麦富脯氨酸类蛋白Tazmhl22的基 因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于出发载体为任何一种可以引导外 源基因在植物中超量表达的载体。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于将所述的小麦富脯氨酸类蛋白 Tazmhl22编码基因插入PBI121表达载体PstI酶切位点所得。
7. 权利要求2所述的基因在品种改良中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求2所述的基因在提高小麦千粒重 中的应用。
9. 权利要求4?6中任一项所述的重组表达载体在品种改良中的应用。
10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于权利要求4?6中任一项所述的重组表达 载体在提高小麦千粒重中的应用。
【文档编号】C12N15/82GK104497111SQ201310726948
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】马正强, 贾海燕, 马省伟, 马丽 申请人:南京农业大学