为18、8的缺失纯合体，分别命名为Cas-tgw6b、 Cas_tgw6e)种植至收获1\代种子，并对T丨代种子进行千粒重调查：Cas_tgw6 b、Cas_tgw6e显 著影响了水稻的千粒重，提高了千粒重5%以上。
[0071] 对于tgw6基因位点双等位杂合个体（编号为4)，需自交后去除潮霉素基因影响， 得到纯合缺失突变体，命名为Cas_tgw6a，然后计算其千粒重，同样的，〇38-丨8*63显著影响 了水稻的千粒重，提高了千粒重5 %以上。
[0072]利用引物Cas9_TGW6testF和Cas9_TGW6testR对突变体Cas_tgw6a、Cas_tgw64P Cas-tgw6e的tgw6突变位点进行PCR检测并测序（图3);
[0073] 其中，突变体Cas_tgw6a*，千粒重基因tgw6的核苷酸序列为：
[0074] ATGAGAAACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTGGTCCA AAAGGCGGGGAGGCAACCGTGCTAGCCATGAAGGCTGATGGCGTGCCACTTCGCTTCACCAATGGGGTGGACATTGA TCAGGTTACCGGAGATGTTTATTTCACCGACAGCAGCATGAACTACCAACGATCTCAGCACGAGCAAGTCACGGCGA CCAAGGATTCGACCGGACGGCTCATGAAGTATGACCCACGAACTAACCAAGTCACCGTTCTTCAATCCAACATAACC TACCCGAACGGTGTCGCCATGAGCGCTGACCGAACACATCTGATCGTTGCATTGACCGGGCCATGTAAGTTGATGAG GCATTGGATCCGAGGCCCGAAGACTGGCAAATCTGAACCATTTGTTGACCTGCCAGGCTATCCTGATAATGTGAGG CCTGATGGAAAAGGTGGTTATTGGATAGCGCTTCATCGCGAGAAGTATGAGCTTCCCTTTGGTCCGGATAGTCACT TGGTTGCTATGAGGGTTAGTGCTGGTGGGAAGCTGGTTCAACAGATGAGAGGACCAAAGAGCTTGAGGCCAACCGAA GTGATGGAGAGGAAGGATGGCAAAATATACATGGGAAATGTTGAATTGCCGTATGTCGGAGTCGTCAAAAGCAGCT AG；
[0075] 突变体Cas_tgw6a，千粒重基因tgw6的氨基酸序列为：
[0076] MRNYKTGNLYIADAYMGLMRVGPKGGEATVLAMKADGVPLRFTNGVDIDQVTCDVYFTDSSMNYQRSQH EQVTATKDSTGRLMKYDPRTNQVTVLQSNITYPNGVAMSADRTHLIVALTGPCKLMRHWIRGPKTGKSEPFVDLPGY PDNVRPDGKGGYWIALHREKYELPFGPDSHLVAMRVSAGGKLVQQMRGPKSLRPTEVMERKDGKIYMGNVELPYVGV VKSS；
[0077] 突变体Cas_tgw6b中，千粒重基因tgw6的核苷酸序列为：
[0078] ATGGGGCGGATCACTGGTCGGCCCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGG CGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAACGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACA CGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCCCCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGG TTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATCGCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTGGTCCAAAAGGCGGGGA GGCAACCGTGCTAGCCATGAAGGCTGATGGCGTGCCACTTCGCTTCACCAATGGGGTGGACATTGATCAGGTTACCG GAGATGTTTATTTCACCGACAGCAGCATGAACTACCAACGATCTCAGCACGAGCAAGTCACGGCGACCAAGGATTCG ACCGGACGGCTCATGAAGTATGACCCACGAACTAACCAAGTCACCGTTCTTCAATCCAACATAACCTACCCGAACGG TGTCGCCATGAGCGCTGACCGAACACATCTGATCGTTGCATTGACCGGGCCATGTAAGTTGATGAGGCATTGGATCC GAGGCCCGAAGACTGGCAAATCTGAACCATTTGTTGACCTGCCAGGCTATCCTGATAATGTGAGGCCTGATGGAAAA GGTGGTTATTGGATAGCGCTTCATCGCGAGAAGTATGAGCTTCCCTTTGGTCCGGATAGTCACTTGGTTGCTATGAG GGTTAGTGCTGGTGGGAAGCTGGTTCAACAGATGAGAGGACCAAAGAGCTTGAGGCCAACCGAAGTGATGGAGAGGA AGGATGGCAAAATATACATGGGAAATGTTGAATTGCCGTATGTCGGAGTCGTCAAAAGCAGCTAG；
[0079] 突变体Cas_tgw6b中，千粒重基因tgw6的氨基酸序列为：
[0080] MGRITGRPGERRVRRQRPRPVQRRLRRPHHEVERRGRWLEHLHVQPQLHEKQVRGIDSPHGPDREQMRP PVRPTVSLQNRQPVHRRRLHGIDASWSKRRGGNRASHEG；
[0081] 突变体Cas_tgw6e中，千粒重基因tgw6的核苷酸序列为：
[0082] ATGAGAATGTTCAAGACCATTGACGCCCGGCGGAGCCAGCATCTGGACCTCGGCGGATCACTGGTCGGC CCGGAGAGCGTCGCGTTCGACGGCAAAGGCCGCGGCCCGTACAGCGGCGTCTCCGACGGCCGCATCATGAGGTGGAA CGGCGAGGCCGCTGGCTGGAGCACCTACACGTACAGCCCCAGCTACACGAAAAACAAGTGCGCGGCATCGACTCTCC CCACGGTCCAGACCGAGAGCAAATGCGGCCGCCCGTTAGGCCTACGGTTTCACTACAAAACCGGCAACCTGTACATC GCCGACGCCTACATGGGATTGATGCGAGTTGGTCCAAAAGGCGGGGAGGCAACCGTGCTAGCCATGAAGGCTGATGG CGTGCCACTTCGCTTCACCAATGGGGTGGACATTGATCAGGTTACCGGAGATGTTTATTTCACCGACAGCAGCATGA ACTACCAACGATCTCAGCACGAGCAAGTCACGGCGACCAAGGATTCGACCGGACGGCTCATGAAGTATGACCCACGA ACTAACCAAGTCACCGTTCTTCAATCCAACATAACCTACCCGAACGGTGTCGCCATGAGCGCTGACCGAACACATCT GATCGTTGCATTGACCGGGCCATGTAAGTTGATGAGGCATTGGATCCGAGGCCCGAAGACTGGCAAATCTGAACCAT TTGTTGACCTGCCAGGCTATCCTGATAATGTGAGGCCTGATGGAAAAGGTGGTTATTGGATAGCGCTTCATCGCGAG AAGTATGAGCTTCCCTTTGGTCCGGATAGTCACTTGGTTGCTATGAGGGTTAGTGCTGGTGGGAAGCTGGTTCAACA GATGAGAGGACCAAAGAGCTTGAGGCCAACCGAAGTGATGGAGAGGAAGGATGGCAAAATATACATGGGAAATGTTG AATTGCCGTATGTCGGAGTCGTCAAAAGCAGCTAG；
[0083] 突变体Cas_tgw6e中，千粒重基因tgw6的氨基酸序列为：
[0084] MRMFKTIDARRSQHLDLGGSLVGPESVAFDGKGRGPYSGVSDGRIMRWNGEAAGWSTYTYSPSYTKN KCAASTLPTVQTESKCGRPLGLRFHYKTGNLYIADAYMGLMRVGPKGGEATVLAMKADGVPLRFTNGVDIDQVTG DVYFTDSSMNYQRSQHEQVTATKDSTGRLMKYDPRTNQVTVLQSNITYPNGVAMSADRTHLIVALTGPCKLMRHW IRGPKTGKSEPFVDLPGYPDNVRPDGKGGYWIALHREKYELPFGPDSHLVAMRVSAGGKLVQQMRGPKSLRPTEV MERKDGKIYMGNVELPYVGVVKSS〇
[0085] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，其特征在于所述的水稻千粒重基因 TGW6引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为： TGW6U3-T1-F :5' -GGCAGCCAGCATCTGGACCTCGG3' ； TGW6U3-T1-R:5' -AAACCCGAGGTCCAGATGCTGGC3' ； TGW6U6a-T2-F :5' -GCCGGCTACAGCCATGAGAAGCA3' ； TGW6U6a-T2-R:5' -AAACTGCTTCTCATGGCTGTAGC3' ； TGW6U6b-T3-F :5' -GTTGAGGCAAGCGGCGACCGCGG3' ； TGW6U6b-T3-R :5' -AAACCCGCGGTCGCCGCTTGCCT3'。2. 权利要求1所述的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组中的 应用。3. 根据权利要求2所述的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组 中的应用，其特征在于： 所述的应用包括将权利要求1所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双链 与载体连接，形成gRNA表达盒；将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到三靶点 CRISPR/Cas9-gRNA载体；将三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体转化植物组织，并将转化的植物 组织培育成转基因植株，得到水稻千粒重基因tgw6突变体。4. 一种三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体，其特征在于：含有权利要求1所述的水稻千粒 重基因TGW6引导RNA靶点序列片段。5. 根据权利要求4所述的三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体的制备方法，其特征在于包含 如下步骤： 将权利要求1所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双链，然后分别与BsaI 酶切后的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA连接，得到三个gRNA表达盒；然后 通过Golden gate cloning的方法将gRNA表达盒全部依次装载到CRISPR/Cas9载体上，得 到三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体。6. 根据权利要求5所述的三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体的制备方法，其特征在于： 所述的Golden gate cloning的引物为： U3-T1-F :5' -TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3' ； U3-T1-R:5' -AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3' ； U6a-T2-F :5' -TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3' ； U6a-T2-R:5' -AGCGTGGGTCTCGTCTTGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3' ； U6b-T3-F :5' -TTCAGAGGTCTCTAAGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3' ； U6b-T3-R :5' -AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'。7. 根据权利要求5所述的三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体的制备方法，其特征在于： 所述的 CRISPR/Cas9 载体为 pYLCRISPR/Cas9Publ-H。8. -种水稻千粒重基因tgw6突变体，其特征在于：是通过将权利要求4所述的三靶点 CRISPR/Cas9-gRNA载体转化植物组织，并将转化的植物组织培育成转基因植株得到的。9. 根据权利要求8所述的水稻千粒重基因tgw6突变体，其特征在于： 所述的水稻的品系为H447 ; 所述的H447为R819/玉香占//R819BC2F7代稳定品系。10.权利要求书8或9所述的水稻千粒重基因tgw6缺失突变体在水稻种植领域中的应 用。
【专利摘要】本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列及应用。所述的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列如SEQ？ID？No.1～6所示。该组靶点序列可以应用于编辑水稻基因组，具有方便、高效等优点。利用本发明提供的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列编辑水稻基因组，水稻千粒重基因tgw6突变频率在90％以上，其中50％多为片段缺失纯合体，有40％左右是双等位杂合突变体。为快速创建稻米品质等生产上有重要应用价值的水稻优异新种质提供了重要参考，并有望为水稻种质资源创新提供了安全、高效的新途径，具有重要的理论和实践意义。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/29, C12N15/11, A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105063026
【申请号】CN201510450692
【发明人】王加峰, 杨瑰丽, 郭涛, 黄明, 刘永柱, 陈志强, 王慧
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月28日