一种圆口铜鱼微卫星标记及其应用_2

含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列。共筛选 出50个含有微卫星重复单元的序列，并从中设计引物进行多态性的检测。
[0022] 2、微卫星引物的设计：
[0023] 从含有微卫星重复单元的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用Primer Premier 5.0进行引物设计。主要参数设置为：引物长度17-25bp，20bp为最适长度，PCR产 物片段长度范围l〇〇_350bp，最适退火温度55-65°C。GC含量一般在40% -60%之间，尽量 避免二级结构出现。
[0024] 3、对设计的引物的扩增产物进行多态性检测：
[0025] (1)基因组DNA的提取：
[0026] 采用酚-氯仿法提取32尾圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA;
[0027] (2)微卫星PCR扩增：
[0028] 用FAM荧光标记上述设计的微卫星引物，扩增圆口铜鱼基因组DNA;反应体系 40yL:模板DNA4yL(10ng/yL)，正反向引物各 2. 0yL(lOpmol/yL)，0? 4yLEx-Taq酶 (5U/yL)，4yL10XPCRbuffer(Mg2+)，3.0yLdNTPs(2.5ymol/yL)，用灭菌双蒸水补足 至 40yL。
[0029] PCR反应在ABI9700PCR仪中进行，扩增程序如下：94°C预变性3min;94°C变性 30s，各标记退火温度下（各标记退火温度分别如表2所示）复性45s，72°C延伸lmin，35个 循环；最终72°C延伸5min。
[0030] (3)测序仪检测扩增产物：
[0031] 将扩增产物避光保存，在ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定圆 口铜鱼微卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
[0032] (4)遗传多样性分析：
[0033] 根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用GENEP0P4. 0. 10计 算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星标记。
[0034] 经过多样性检测，本发明共筛选出8个具有遗传多态性的微卫星标记，其核苷酸 序列分别如SEQIDN0 :1-8所示，其所对应的扩增引物的信息如表1所示。
[0035] 表1圆口铜鱼微卫星标记及其对应的引物
[0036]
[0037] 如表2所示，在32个圆口铜鱼样本中对上述8个微卫星标记进行遗传多样性分 析的结果表明：每个微卫星标记的等位基因数目从6到20不等，平均等位基因数目为11. 5 个，观测杂合度的范围从0. 250到0. 906,期望杂合度的范围从0. 711到0. 940。从而证明 本发明筛选的微卫星标记和设计的引物具有遗传多态性。
[0038] 表2 8个微卫星标记的退火温度、片段长度、多态性等相关信息
[0039]
[0040] 本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于圆口铜鱼的遗传多样性、放流效果评 估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。
[0041 ]
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[004J」
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【主权项】
1. 圆口铜鱼微卫星标记，其特征在于： 其核苷酸序列分别如SEQ ID NO : 1-8所示，或 其核苷酸序列与1)中的核苷酸序列互补。2. 用于扩增权利要求1所述的圆口铜鱼微卫星标记的引物对，所述的引物对设计参数 为：引物长度17_25bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65°C，GC含量 在40%-60%之间。3. 用于扩增权利要求1所述的圆口铜鱼微卫星标记的引物对，其特征在于：其上下游 引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 10所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12所示，其扩增 核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO: 14所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的微卫星标记；其上下游序列分别 如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的微卫星标 记；其上下游序列分别如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示，其扩增 核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示的微卫星标记；其上下游序列分别如SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :7所示的微卫星标记；和/或，其上下游序 列分别如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所示，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示的微 卫星标记。4. 使用权利要求2或3所述的引物对检测圆口铜鱼种群遗传多样性的方法，包括如下 步骤： (1) 提取圆口铜鱼基因组DNA ; (2) 微卫星PCR扩增：采用经荧光标记的权利要求2或3所述的引物对，以圆口铜鱼基 因组DNA为模板进行PCR，获得圆口铜鱼个体微卫星扩增产物； (3) 测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，用ABI 3730XL测序仪进行毛细管电 泳和STR分析； (4) 遗传多样性分析：根据每个圆口铜鱼个体的微卫星扩增产物的分子量大小确定基 因型，采用GENEP0P 4. 0. 10计算遗传多样性参数； 优选地，步骤（1)采用酚-氯仿法提取圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA。5. 权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在检测圆口铜鱼种群 遗传多样性中的应用。6. 权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在分析圆口铜鱼亲缘 关系中的应用。7. 权利要求1所述的微卫星标记或权利要求2或3所述的引物对在圆口铜鱼辅助育种 中的应用。
【专利摘要】本发明涉及8个圆口铜鱼微卫星标记、其扩增引物对及其应用。本发明从圆口铜鱼基因组DNA中筛选了8个微卫星标记，并在微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物进行扩增，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可用于圆口铜鱼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105063031
【申请号】CN201510473558
【发明人】熊美华, 闫书祥, 邵科, 朱滨
【申请人】中国长江三峡集团公司, 水利部中国科学院水工程生态研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月5日