一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶bcr文库的多重pcr引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于高通量测序构建白血病微小残 留病灶BCR文库的多重PCR引物和方法。
【背景技术】
[0002] 白血病（leukemia)是以骨髓和/或外周血中幼稚细胞增多为特征的血液系统恶 性克隆性疾病。在初诊时，病人体内白血病细胞总数约为1〇 12,经化疗取得形态学的完全 缓解（CompleteRemission，CR)后，残留的白血病细胞总数低于109,这种形态学方法难以 检测、且体内仍残存着少量白血病细胞的状态称为白血病微小残留病（minimalresidual diseaSe，MRD)。体内残留的MRD使急性T淋巴白血病患者有>50%复发率。因此要定期检 测MRD，对设计个体化的治疗方案显得更为重要。
[0003] B细胞基因座上大量V、J基因片段在受体的合成中会产生各种多样重排，在V-J， V-D和D-J接合体之间的核苷酸不依赖模板插入或删除，与高频变异类似，这进一步增加了 受体潜在的多样性。受体的这种潜在多样性很难随机产生相同的CDR3序列，从而使每个 ⑶R3序列有效地成为一个B细胞克隆的唯一标签。因此对于B淋巴细胞IGH基因⑶R3区 域的序列组成进行测序可以很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。
[0004] 目前临床上MRD的主要检测方法是：多参数流式细胞术（multiparametricflow cytometry，mpFC)和实时定量PCR技术。虽然mpFC对于复发疾病的检测灵敏度为10 4,但 是复杂的多维数据依赖于实验人员分析，人为因素影响大，不利于临床标准化检测。此外， 在化疗后白血病抗原的表达水平对MRD的mpFC检测具有干扰作用。依赖于分子手段可以提 高检测MRD的灵敏度，可以达到10 5;然而，实时定量PCR需根据患者设计特殊的引物将多 样性丰富的重排序列扩增出来，其检测费用昂贵、劳动力密集、很难形成标准化实验流程。
[0005] 得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基 因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。因此，提供一种基于高通量测序构建白血病微 小残留病灶BCR文库的多重PCR引物和方法。
【发明内容】
[0006] 鉴于此，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的 多重PCR引物和方法。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文 库的多重PCR引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物为比SEQIDNO: 1~SEQID NO: 13所示的核苷酸序列多或少0~3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
[0008] 所述下游引物为比SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多或少0~ 3个碱基的核苷酸序列组成的。
[0009] 如本发明所述的，"碱基"可代表核苷酸，比如，计数时，用lbp代表1个核苷酸。
[0010] 如本发明所述的，"多或少〇~3个碱基"，优选为在对应引物的3'端多或少0~ 3个碱基。
[0011] 本发明通过针对人BCR的可变区V区（variable)设置至少13条上游引物序列，针 对BCR的连接区（joining)J区设置至少4条下游引物序列，通过多重PCR扩增目的片段， 获得多重PCR产物构建BCR高通量测序文库。
[0012] 优选地，所述上游引物为SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所示的核苷酸序列组成的 上游引物组，所述下游引物为SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列组成的下 游引物组。
[0013] 如本发明所述的，所述比SEQIDNO: 1~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多出的 1~3个碱基为与目的BCR互补的碱基。
[0014] 如本发明所述的，本领域技术人员可以理解的，所述的"比SEQIDNO: 1~SEQID NO: 13或SEQIDNO: 14~SEQIDNO: 17所示的核苷酸序列多或少0~3个碱基的核苷酸 序列"为本领域技术人员在设计PCR引物时，在如"SEQIDNO: 1~SEQIDN0:17所示的核 苷酸序列"的基础上，适当的延长或截短PCR引物长度即可获得（延长部分仍然与相应的目 的片段互补）；
[0015] 本领域技术人员可以理解的，若摸索的多重PCR引物组（"SEQIDNO: 1~SEQID NO: 17所示的核苷酸序列"）获得了较佳的扩增效果，在可预测范围内，适当的将各条引物延 长或截短0~3个碱基后所得多重PCR引物组，也可以获得较佳的多重PCR扩增效果。
[0016] 优选地，所述下游引物的5'端和上游引物的5'端分别包括标签序列，所述标签序 列为由6~8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不 同。
[0017] 本发明提供的带标签序列的引物可以给待测样品中的每个RNA分子或DNA分子都 加上了 一个标签序列，所述标签序列由ATCG四种基本碱基随机组合，且所述标签序列互不 相同，例如，标签序列的碱基个数是八个时（本发明实施例中表示为8N标签序列），可以获 得109个不同的标签序列组合；标签序列的碱基个数是七个时，可以获得10 8个不同的标签 序列组合；标签序列的碱基个数是六个时，可以获得1〇7个不同的标签序列组合，所述标签 序列的碱基个数是八个，或者七个，或者六个。
[0018] 第二方面，本发明提供了一种基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库 的多重PCR方法，包括如下步骤：
[0019] 取待测样品；
[0020] 采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，多重PCR反应采用的引 物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物为3'端比SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所 示的核苷酸序列多或少〇~3个碱基的核苷酸序列组成的上游引物组；
[0021] 所述下游引物为3'端比SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列多或 少0~3个碱基的核苷酸序列组成的。
[0022] 优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。
[0023] 当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配 置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时， 逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组），合 成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组）。
[0024] 优选地，所述待测RNA样品为（优选采用RNA试剂盒）提取人外周血单个核细胞 获得的总RNA。
[0025] 优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多 重PCR产物的步骤为：先以下游引物组为反转录引物合成cDNA;然后以合成的cDNA为模 板，加入上游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
[0026] 优选地，当待测样品为RNA样品，所述的采用多重PCR反应，扩增待测样品，获得多 重PCR产物的步骤为：先以上游引物组为反转录引物合成cDNA;然后以合成的cDNA为模 板，加入下游引物组，进行多重PCR，扩增cDNA，获得多重PCR产物。
[0027] 优选地，所述上游引物为SEQIDNO: 1~SEQIDN0:13所示的核苷酸序列组成的 上游引物组，所述下游引物为SEQIDN0:14~SEQIDN0:17所示的核苷酸序列组成的下 游引物组。
[0028] 优选地，所述多重PCR反应的体系中，13条上游引物组成的上游引物组中，各上游 引物等摩尔混合；4条下游引物组成的下游引物组中，各下游引物等摩尔混合。
[0029] 优选地，所述下游引物的5'端和上游引物的5'端分别包括标签序列，所述标签序 列为由6~8个核苷酸序列组成的序列条码，其中，所述序列条码之间至少有一个核苷酸不 同。
[0030] 优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为1~3ug/50ul体系。
[0031] 优选地，所述多重PCR反应的程序为：
[0032]
[0033] 上述程序具体为：95°C预变性15min，94°C变性15s，65°C退火90s，72°C延伸30s， 循环25~30次，最后72°C后延伸lOmin。
[0034] 优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为100-150bp的DNA 片段。
[0035] 本发明提供的BCR高通量测序文库能获得的长度和数量丰富的BCR序列，有利于 BCR序列的多态性程度分析及BCR高克隆CDR3区长度多态性分布分析。
[0036] 优选地，将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，并通过生物信息学分 析高通量测序结果。
[0037] 在高通量测序平台的基础上，通过对人BCR基因⑶R3区域进行全面的生物信息学 分析，获得了BCR在VDJ重组时的基因偏好性（usagepatterns)，基因组合、连接多样性信 息，以及CDR3序列中氨基酸的偏好性（usagepatterns)、CDR3氨基酸序列的长度多样性以 及连接处N端碱基的特性。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的BCR受体库。
[0038] 第三方面，本发明提供了一种检测白血病微小残留病灶BCR多样性的试剂盒，包 括如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物。
[0039] 第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于高通量测序构建白血病微小 残留病灶BCR文库的多重PCR引物或第二方面所述的基于高通量测序构建白血病微小残留 病灶BCR文库的多重PCR方法在检测白血病微小残留病灶BCR多样性中的应用。
[0040] 本发明提供的基于高通量测序构建白血病微小残留病灶BCR文库的多重PCR引物 及方法的有益效果为：1)获得了人BCR序列；2)获得了人特异性的BCRCDR3序列，尤其提 高了低拷贝数B细胞克隆的检出率。
【附图说明】
[0041] 图1为本发明实施例提供的基因组及PCR产物的琼脂糖凝