专利名称：产(r, r)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产{R，奶-2，3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
2，3- 丁二醇(2，3-Butanediol)是一种重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域，具有良好的应用前景；同时，通过特定的化学反应，2，3- 丁二醇可以衍生出多种重要的化学品如3-羟基丁酮、甲乙酮及1，3-丁二烯。因此，它被视作一种极具潜力的平台化合物。
2，3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，因此存在三种立体异构体。其中{R，R)~2, 3- 丁二醇不仅具有混旋型2，3- 丁二醇的一般功能，而且还可以用于制备手性化学品以及作为高级防冻剂。目前，{R,R)-2, 3- 丁二醇的生产主要采用化学合成法，先由I- 丁醇脱水得1_ 丁烯，再经加成得2-氯-丁烷，再消除得2- 丁烯，再与次溴酸反应生成3-溴-2- 丁醇，然后在碱液中水解可得到2，3-丁二醇的外消旋混合物，最后通过外消旋体的拆分得到{R，7 ) 2，3-丁二醇(纪晓俊，聂志奎，黎志勇，高振，黄和.化学进展，2010，22:2450-2461);但是化学合成法过程繁琐，最后还需要通过化学法进行手性拆分，因此成本高、难以实现大规模生产。在制备化学品的方法中，微生物制造方法与化学合成法相比，其原料丰富、工艺简单、环境友好，因此越来越受到各国科学家的青睐。据报道，传统的天然微生物一般都生成两种不同构型2，3- 丁二醇的混合物，至今还没有发现单一生成某种构型2，3- 丁二醇的微生物(CeliAska E, Grajek, ff. Biotechnol Adv, 2009, 27: 715 - 725)。利用传统的天然微生物发酵法难以实现单一构型的2，3-丁二醇的高纯积累，而且由于不同立体构型2，3- 丁二醇的物理化学性质十分相近，实现其分离很困难，故通过构建能够产单一构型2，3- 丁二醇的基因工程菌则有望解决该问题。据报道，目前构建出的基因工程菌都只能在IPTG存在的情况下表现出较强的外源蛋白表达和目标产物积累的能力，且产^奶-2，3-丁二醇的能力均偏低。诱导剂对细胞的生长有一定的抑制作用，且价格相对昂贵，若利用基因工程菌进行工业化生产，诱导剂的添加必会大幅增加成本，不利于{R，奶-2，3-丁二醇的规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供产^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，该基因工程菌能在不添加任何诱导剂的情况下发酵产高纯度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。本发明的另一目的是提供上述基因工程菌的构建方法，该方法简单，效率高。本发明的再一目的是提供上述基因工程菌在制备{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的应用，该制备方法简单，产率高，对环境友好，成本低廉。本发明的目的采用如下技术方案实现。
产汰7 )-2，3-丁二醇的基因工程菌，是将如00基因、如说基因和_70^基因通过表达载体导入宿主菌得到的重组菌。所述宿主菌为大肠杆菌{Escherichia coif) MG1655。所述表达载体为pTrc99a。一种构建所述产{R，R)~2, 3- 丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步骤
(1)从肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分别扩增Zwt/i 基因和基因，从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) 168中扩增基因；
(2)利用重叠延伸PCR技术将budB基因、budA基因和JOrJZ基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因；
(3)将所述融合基因插入表达载体的多克隆位点处，得到重组质粒；
(4)将所述重组质粒导入宿主内即得所述产{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。步骤(I)中用于扩增too 基因的引物为Pl和P2 ;用于扩增基因的引物为P5和P6 ;用于扩增基因的引物为P9和PlO ；
所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分别为
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，
P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。步骤(2)的具体方法为
(1)将步骤(1)所得如必基因
与pMD 18-simp Ie-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4为引物扩增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下
P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
(II)将况/说基因与载体pMD18-simp Ie-T相连,获得重组质粒pMD18-simple-T-/wo^,以P7和P8为引物扩增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；
(III)将ydjL 基因与载体 pMD 18-simp Ie-T 相连,获得重组质粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12为引物扩增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；
(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物I ;以所述扩增产物I为模板，以P7及P12为引物扩增获得ZwW基因与基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下
P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，
P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；以budA基因与_7心1基因的融合基因和拼接序列I的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物2 ;以扩增产物2为模板，P13及P14为引物，进行扩增，获得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下
P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’，
P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。一种所述基因工程菌在制备(M，奶-2，3-丁二醇方面的应用，将基因工程菌接种至发酵培养基，在摇床转速18(T220r/min、35_38°C条件下发酵3(T48h，收获含有{R，R)~2, 3-丁二醇的发酵液；
所述发酵培养基为葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏T7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨苄青霉素20 50 Pg/mL，溶剂为水。有益效果
本发明基因工程菌性质稳定，在不添加诱导剂的情况下，以葡萄糖为底物高产高纯度的说奶_2，3-丁二醇，突破了以往报道基因工程菌需要添加诱导剂的限制。摇瓶发酵结果该基因工程菌可利用80g/L葡萄糖，产出32. 2g/L的{R, R) -2，3- 丁二醇，对映体纯度高达99. 5%，相对于葡萄糖的转化率为40. 3%，理论最高转化率为50% ;在上述相同条件下，原始菌株几乎不耗糖，与原始的大肠杆菌菌株相比，在导入有效的^ 7 )-2，3_丁二醇合成途径后，重组菌不仅实现了 {R，奶_2，3-丁二醇从无到有的合成，而且也不需要诱导剂的作用。与目前文献报道的大肠杆菌产汰奶-2，3-丁二醇产量相比，产物终浓度也是相对最闻的。本发明构建基因工程菌的方法，巧妙、简单、效率高。本发明基因工程菌用于发酵制备{R，奶_2，3-丁二醇，方法简单，产率高，对环境友好，成本低廉。发酵液中仅存在单一构型的、R，奶_2，3-丁二醇，因此不需要复杂的拆分步骤。在发酵过程中，不需要添加诱导剂IPTG，成本低。
图I为budB、budA和_7<3冗这三种基因的拼接模式示意图。图2为三种外源基因在宿主细胞coli MG1655中成功表达的SDS-PAGE图谱；M为SDS-PAGE低分子量Marker ；Lane I为添加了诱导剂IPTG的原始菌；Lane 2未经IPTG诱导的基因工程菌；Lane 3为IPTG诱导的基因工程菌。图3 ■、職Escherichia coli MG1655的发酵液高效液相色谱图。图 4 为基因工程菌coli加 IPTG 诱导情况下的发酵液高效液相色谱图，其中I是3-羟基丁酮；2是汰7 )-2，3_ 丁二醇。图5 为基因工程菌coli"^无 IPTG 诱导情况下的发酵液高效液相色谱图，其中I是3-羟基丁酮；2是iR，R)~2, 3- 丁二醇；3是乙醇。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明中的生物材料来源如下
Klebisella pneumoniae CICC10011 菌株(缩写为尤 pneumoniae CICC10011 菌株):购于中国微生物菌种保藏中心；
枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is) 168 (缩写为B. subtil is 168菌株)购于中国工业微生物菌种保藏中心；
pMD 18-simp Ie-T载体商业载体，购于TaKaRa公司(宝生物工程有限公司)；
PUC18 :商业载体，购于TaKaRa公司(宝生物工程有限公司)； pTrc99a载体商业载体，购于上海北诺生物科技有限公司；
Escherichia coli MG1655 :由广东菌种保藏中心代购于美国菌种保藏中心(编号ATCC 700926)。本发明中ZwoS基因为α -乙酰乳酸合成酶编码基因，budA基因为α -乙酰乳酸脱羧酶编码基因，_7心1基因为^奶_2，3-丁二醇脱氢酶编码基因。实施例I :重组质粒的构建
(I)基因too 的克隆
根据Genebank公布的肺炎克雷伯氏杆菌Of. pneumoniae)中基因序列设计合成引物
Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’
P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’
以K. pneumoniae CICC10011菌株的基因组DNA为模板，应用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 进行 PCR 扩增 too 基因。PCR 反应体系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，弓丨物 Pl O. 5 μ L，引物P2 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因组 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反应程序98°C变性208，55 621退火30s，72°C延伸lmin48s，循环30轮；最后10 C保温。将PCR产物以0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用TakaraDNA A-Tailing Kit在PCR产物3’端加A，然后与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD 18-simple-T-Zwt/i ,进行序列测定。Zwt/i 基因的序列如SEQ ID NO: I所不。以重组质粒pMD18-simple-T-too0为模板，P3和P4为引物，应用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增含有too 基因的拼接序列I。P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’ ；
P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ；
PCR 反应体系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，$*P3 0.5yL，$*P30. 5μ L, pMD18-simple-T-too0质粒DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0· 25 μ L。PCR程序为98°C变性10s，68°C退火加延伸2min，循环30轮；最后10°C保温。反应结束后，0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。拼接序列I用于之后的重叠延伸PCR反应，其组成是在too 基因的前端加了SacI酶切位点和RBS序列，在Zwi浴基因后端加了与拼接序列2前端相重叠的15 20bp。
(2)基因budA的克隆
根据Genebank公布的肺炎克雷伯氏杆菌Of. pneumoniae)中基因序列设计合成引物
P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，
P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’。以尤pneumoniae CICC 10011菌株的基因组为模板进行PCR扩增，应用Takara高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 扩增基因。PCR 反应体系:ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 P5 O. 5 μ L，引物P6 O. 5 μ L, K. pneumoniae CICC1001 基因组 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反应程序98°C变性10s，55°C退火15s，72°C延伸48s，循环30轮；最后10°C保温。 PCR产物以O. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR产物3’端加A，然后再与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-/w<i4,进行序列测定。基因的具体序列如SEQ ID N0:2所示。以重组质粒pMD18-simple-T-toi/ A为模板，P7和P8为引物，扩增含有to说基因的拼接序列2。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，
P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ 。PCR 反应体系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ7 O. 5 μ L，弓I物 P8 O. 5μ L, pMD18-simple-T-too^ 质粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反应程序为98°C变性10s，55 65°C退火15s，72°C延伸50s，循环30轮，最后10°C保温。反应结束后，O. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。拼接序列2用于之后的重叠延伸PCR，其组成是在基因的前端加入SacI酶切位点，在况/说基因的后端具有与基因如段序列相重置的部分。(3)基因的获取
根据Genebank公布的枯草芽孢杆菌(β· subtil is)中基因序列设计合成引物 P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，
PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。以B. subtilis 168菌株的基因组为模板进行PCR扩增，应用Takara高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase 扩增基因。PCR 反应体系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，弓I 物 Ρ9 O. 5 μ L，弓I物 PlO O. 5μ L, B. subtilis 168 基因组 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反应程序981变性108，571退火158，721延伸11^11，循环30轮；最后10 C保温。 PCR产物以O. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，经PCR纯化试剂盒纯化后，用Takara DNAA-Tailing Kit在PCR产物3’端加Α，然后再与pMD18-simple-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-_Fi/jZ,进行序列测定。JOrJZ基因序列如SEQ ID N0:3所示。以重组质粒pMD18-Simple-T-j</Z为模板，Pll和P12为引物，扩增含有WjZ基因的拼接序列3。
Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3> 。PCR 反应体系ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2 μ L，引物 Pll O. 5 μ L，引物 P12 O. 5μ L, pMD18-simple-T-_Fi/jZ 质粒 DNA 2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 25 μ L0PCR反应程序为98°C变性10s，59. 1°C退火15s，72°C延伸IminlOs，循环30轮，最后10°c保温。反应结束后，0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。拼接序列3用于之后的重叠延伸PCR，其组成是..电ydJL基因的前端具有与基因后段序列的相重叠部分，在_7心1基因的后端加入BamHI酶切位点。(4)重叠延伸PCR反应拼接to说基因和基因
重叠延伸PCR获得ZwW基因与JOrJZ基因的融合基因，分为两步反应。重叠延伸PCR第一步反应中，不加引物，以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，每管的反应体系是ddH20 12 μ L7Buffer 5 μ L, dNTP 2yL，拼接序列2和拼接序列 3 各 3 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 3 μ L。PCR 反应条件98°C 变性10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 IminlOs，循环 8 轮；10°C保温。重叠延伸PCR的第二步反应中，将第一步反应产物稀释100倍后作为模板，P7和P12为引物，扩增获得ZwW基因与_7心1基因的融合基因。每管的反应体系是ddH20 14. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P7 O. 5yL，引物 Ρ12 0. 5yL,模板 2yL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 25 μ L0 PCR 反应条件98°C变性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸2min，循环30轮，10°C保温。P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，,
P12 :5， -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3，。P7引物前端有SacI酶切位点，P12引物后端有BamHI酶切位点。(5)重叠延伸PCR反应拼接budB基因、budA基因和70 基因
重叠延伸PCR获得budB、budA、ydjL三种基因的融合基因，分为两步PCR反应。重叠延伸PCR反应第一步中，不加引物，以Zw说基因与基因的融合基因和拼接序列I的重叠部分互为模板进行扩增，每管的反应体系是ddH20 12 μ L, Buffer 5 μ L,dNTP 2 μ L，budA基因与基因的融合基因3 μ L，3 μ L拼接序列1，PrimeSTAR HS DNAPolymerase O. 3 μ L ;反应程序为98°C 变性 10s，55°C 退火 15s，72°C延伸 2min，循环 8轮，10°C保温。重叠延伸PCR的第二步反应中，以第一步反应产物作为模板，P13及P14为引物，扩增获得too 基因、budA基因和基因的融合基因。每管的反应体系是ddH2014. 75 μ L, Buffer 5 μ L, dNTP 2yLj|*P13 0. 5yL，引物 Ρ14 0. 5 μ L，第一步反应产物2 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase O. 25 μ L ;反应程序为98°C变性 10s，57°C 退火15s，72°C延伸4min，循环29轮，10°C保温。P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3，P14 :5 ’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3，
这对引物前端有SacI酶切位点，后端有BamHI酶切位点。反应结束后，O. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后经PCR纯化试剂盒纯化。将PCR回收产物与pUC18载体连接获得重组载体进行序列测定,发现序列正确。SacI 和 BamHI 酶切重组载体 ^MCVd-budBbudAydjL，回收和的融合基因(约3. 5Kb片段)；同时SacI和BamHI酶切pTrc99a载体，回收大片段产物；将双酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下连接从而获得重组质粒x^d-budBbudAydjL。budB基因、budA基因和基因的拼接模式见图I。实施例2 :制备基因工程coli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL 利用电击穿孔仪将重组质粒dBbudAydjL转化大肠杆菌coli
MG1655，电转化参数为电压2. 5 kv，200 Ω，脉冲时间4. 5 msec。电击转化完毕，将经电击处理过的coli MG1655涂布于含有50 Pg/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C培养12 16小时，然后挑取阳性转化子，经质粒提取酶切验证后，确定得到重组大肠杆菌，命名 ％ Escherichia coli WGl&^-plrd^a-budBbudAydjL。实施例3 基因工程菌coli Μ61655-ρΤιχ99Β-Α ￡/^ ο^/ ^ 的稳定性
考察方法 .洛Escherichia coli MG1655-pTrc99a-/wi/i /wiilF￡/jZ 接种至 3mL 不含氨节青霉素的LB培养基中，37°C下培养12h作为种子，转种培养24h (即传种20代)，转种培养5次(即传种100代)。将上述菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，从中挑取100个单菌落分别点在添加和不添加氨苄青霉素的LB平板上，37°C下培养12 16h，比较在添加和不添加氨苄青霉素的LB平板上的菌落数，即其稳定性。考察结果传种100代之后，其质粒稳定性为99%。实施例4 :基因工程菌coli诱导后的蛋白表达考察
(1)出发菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99 -budBbudAydjL
(2)以诱导蛋白表达为目的的基因工程菌培养
培养基葡萄糖50 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3g/L, NaCl 5g/L,氨节青霉素20 Pg/mL,溶剂为水；
培养条件50mL培养基装于250mL锥形瓶中，37°C、200rpm培养至0D_在O. 6^0. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培养8h，诱导外源蛋白充分表达。同时设立不用IPTG诱导的基因工程菌的培养作为对照。该培养过程中不添加IPTG，其他培养条件与IPTG诱导基因工程菌相同。(3)诱导后基因工程菌的细胞破碎取步骤(2)获得的培养液3ml，4000rpm、4°C下离心5min，用pH7. 4的磷酸钠缓冲液洗涤一次、重悬至3ml ;冰浴下超声破碎细胞(2s，3s, 15min, 300W);然后 12000rpm, 4°C 下离心 20min,取上清；取 30ul 上清与 IOul4*SDS_PAGE loading buffer混合于灭菌的I. 5ml离心管，煮沸5min后放于_20°C冰箱备用。
(4)将煮沸后的样品用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察是否有外源蛋白表达。考察结果在SDS-PAGE图谱(见图2)中，可以看出对应IPTG诱导基因工程菌的泳道上，能够看到表达的三种外源蛋白的明显条带；同时，可以发现IPTG诱导基因工程菌表达的目的蛋白量比未经IPTG诱导基因工程菌显著增加。对比例I ·.原展·Escherichia coli MG1655诱导后的蛋白表达考察
(1)出发菌株-,Escherichiacoli MG 1655
(2)诱导蛋白表达为目的的原始菌培养
培养基葡萄糖50 g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏3g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水；
培养条件50mL培养基装于250mL锥形瓶中，37°C、200rpm培养至0D_在O. 6^0. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm培养8h，保证与基因工程菌的同等培养及诱导条件。(3)诱导后原始菌的细胞破碎取诱导后的培养液3ml，4000rpm、4°C下离心5min,用pH7. 4的磷酸钠缓冲液洗漆一次、重悬至3ml ;冰浴下超声破碎细胞(2s, 3s,15min, 300W);然后12000rpm, 4 °C下离心20min, 转移上清；取30ul上清与IOul4*SDS_PAGE loadingbuffer混合于灭菌的I. 5ml离心管，煮沸5min后放于-20度冰箱备用。(4)将煮沸后的样品用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，观察原始菌的蛋白表达情况。考察结果原始菌的SDS-PAGE凝胶图与基因工程菌的SDS-PAGE凝胶图相比(见图
2)，没有发现三种外源蛋白的表达条带。这种对比结果说明，基因工程菌中已经实现了原始菌中不存在的三种外源蛋白的成功表达。实施例5 :基因工程菌coli发酵产{R，奶-2，3_ 丁二醇
方法一
无 IPTG 诱导的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 发酵产{R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出发菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)种子液制备
种子培养基蛋白胨5 g/L，酵母膏3 g/L,NaCl 5g/L，氨苄青霉素2(^g/mL，溶剂为水； 培养条件50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37°C，摇床转速180r/min，培养
12h。(3)发酵培养
发酵培养基葡萄糖80 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母膏3 g/L, NaCl 5 g/L,氨节青霉素20Pg/mL，溶剂为水；
培养条件接种量5% (v/v)，发酵温度37°C，全程不添加诱导剂，摇床转速180r/min，发酵30h。设计基因工程菌在IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在O. 6 O. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. O mmol/L，然后30°C、200rpm诱导培8h，再转回37°C、180rpm进行发酵，发酵总时间30h。其他培养条件同无IPTG诱导的基因工程菌。设计原始菌coli MG1655的对照,种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。发酵结果将发酵液离心后，采用高效液相色谱检测。基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将80g/L葡萄糖转化得到32.28/1的汰奶-2，3_ 丁二醇(见图5)。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖20g/L，生成iR，R)~2, 3- 丁二醇5. 7g/L(见图4)。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到iR，奶-2，3-丁二醇生成(见图3)。{R, R)~2, 3- 丁二醇采用高效液相色谱检测采用日本岛津高效液相色谱仪，RID-10A示差折光检测器，Aminex HPX-87H(美国Bio-Rad公司)色谱柱。柱温箱温度65°C，流动相为 O. 005 mol/L H2SO4,流速为 0.6 mL/min。
方法二
无 IPTG 诱导的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 发酵产{R，R) ~2, 3- 丁二醇
(1)出发菌株-,Escherichiacoli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)种子液制备
种子培养基蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L, NaCl 10 g/L，氨苄青霉素50 Pg/mL，溶剂为水；
培养条件50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37 °C，摇床转速220r/min，培养
16h。(3)发酵培养
发酵培养基葡萄糖200 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏7 g/L,NaCl 10 g/L，氨苄青霉素50 Pg/mL，溶剂为水；
培养条件接种量10%(v/v)，发酵温度37°C，全程不添加诱导剂，摇床转速220r/min，发酵48h。设计基因工程菌在加IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在O. 6 O. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm诱导培8h，再转回37°C、220rpm进行发酵，发酵总时间48h。其他培养条件同无IPTG诱导的
基因工程菌。设计原始菌coli MG1655的对照,种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。发酵结果基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将200 g/L葡萄糖转化得到75. 5g/L的iR，R) -2，3- 丁二醇。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖38g/L，生成{R, R) _2，3- 丁二醇10. 6g/L。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到{R，R) _2，3- 丁二醇生成。方法三
无 IPTG 诱导的基因工程菌coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL 发酵产{R，R) ~2, 3- 丁二醇(1)出发菌株'Escherichia coli MG1655-pTrc99a-budBbudAydjL
(2)种子液制备
种子培养基蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨苄青霉素35 Pg/mL，溶剂为水；
培养条件50mL培养基装于250mL锥形瓶中，培养温度37 °C，摇床转速200r/min，培养
14h。
(3)发酵培养
发酵培养基葡萄糖140 g/L，蛋白胨7. 5 g/L，酵母膏5 g/L, NaCl 7.5 g/L，氨苄青霉素35 Pg/mL，溶剂为水；
培养条件接种量7. 5%(v/v)，发酵温度37°C，全程不添加诱导剂，摇床转速200r/min，发酵39h。设计基因工程菌在加IPTG诱导条件下发酵的对照，基因工程菌在发酵培养基中培养至OD600在O. 6 O. 8时加IPTG诱导，IPTG的终浓度I. O mmol/L,然后30°C、200rpm诱导培养8h，再转回37°C、200rpm进行发酵，发酵总时间39h。其他培养条件同无IPTG诱导的基因工程菌。设计原始菌coli MG1655的对照,种子培养基和发酵培养基中均不添加氨苄青霉素，其它培养条件与无IPTG诱导的基因工程菌相同。发酵结果基因工程菌在没有IPTG诱导的条件下，能将140 g/L葡萄糖转化得到55g/L的iR，R)~2, 3- 丁二醇。基因工程菌在有IPTG诱导的条件下，仅耗糖29g/L，生成{R,奶_2，3-丁二醇8. lg/L。原始菌仅消耗极少量葡萄糖，未检测到^ 7 )-2，3-丁二醇生成。通过上述发酵过程可以发现，虽然IPTG诱导后基因工程菌表达了大量的目的蛋白，但是发酵液中目的产物{R，奶_2，3-丁二醇的浓度却不高；没有IPTG诱导的基因工程菌表达的目的蛋白量虽然少，但是发酵液中却有高浓度的iR，奶-2，3_ 丁二醇。其原因可能是基因工程菌不加IPTG诱导的本底表达就可满足细菌代谢及iR，R)~2, 3-丁二醇的大量合成；而添加IPTG后，蛋白大量表达可能引起无活性的包涵体生成，使得2，3-丁二醇途径活性大量降低，同时IPTG对细胞也有毒害作用。
权利要求
1.产(疋/ )-2，3- 丁二醇的基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体导入宿主菌得到的重组菌。
2.根据权利要求I所述产{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌 i^scherichia coif) MG1655。
3.根据权利要求2所述产{R，/ )-2，3-丁二醇的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pTrc99a。
4.一种构建权利要求1-3所述产^奶_2，3-丁二醇的基因工程菌的方法，包括如下步骤 (1)从肺炎克雷伯氏杆菌{Klebsiellapneumoniae) CICC 10011中分别扩增Zwt/i 基因和ZwW基因，从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) 168中扩增_7心1基因； (2)利用重叠延伸PCR技术将budB基因、budA基因和基因拼接得到budB基因、budA基因和基因的融合基因； (3)将所述融合基因插入表达载体的多克隆位点处，得到重组质粒； (4)将所述重组质粒导入宿主内即得所述产{R，奶_2，3-丁二醇的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述构建产{R，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步骤(I)中用于扩增budB基因的引物为PI和P2 ;用于扩增budA基因的引物为P5和P6 ;用于扩增基因的引物为P9和PlO ； 所述P1、P2、P5、P6、P9和PlO序列分别为Pl :5’ -GATATGGACAAACAGTATCCGGT-3’，P2 :5’ -GCGTTACAGAATCTGACTCAGAT-3’，P5 :5’ -GCTATGAATCACTCTGCTGAATG-3’，P6 :5’ -GTCTTAACTTTCTACGGAACGGA-3’，P9 :5， -TCACCATGGGCATGAAGGCAGCAAGA-3，，PlO :5， -GGCGTCGACTTAGTTAGGTCTAACA-3，。
6.根据权利要求5所述构建产iR，R)~2,3-丁二醇的基因工程菌的方法，其特征在于步骤(2)的具体方法为 (I)将步骤(I)所得too 基因与pMD 18-simp Ie-T载体相连获得重组质粒pMD18-simple-T-too ，以P3和P4为引物扩增出含有budB基因的拼接序列I ;所述P3和P4的序列如下P3 :5’ -TATGACCATGATTACGAGCTCTAAGGAGGATATACATATGGACA AACAG TATC-3’，P4 :5’ -AGCAGAGTGATTCATATGTATATCCTCCTTATTACAGAATCTGAC TCAGATGC-3’ ； (II)将况/说基因与载体pMD18-simp Ie-T相连,获得重组质粒pMD18-simple-T-/w￡/y4,以P7和P8为引物扩增出含有budA基因的拼接序列2 ;所述P7和P8的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P8 :5’ -TGTATATCCTCCTTATTAACTTTCTACGGAACGGAT-3’ ；(III)将ydjL 基因与载体 pMD 18-simp Ie-T 相连,获得重组质粒 pMD18-simple-T-_7t/jZ，以Pll和P12为引物扩增出含有基因的拼接序列3 ;所述Pll和P12的序列如下Pll :5’ -TCCGTAGAAAGTTAATAAGGAGGATATACATATGAAGGCAGCAA GA-3’，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ；(IV)以拼接序列2和拼接序列3的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物I ;以所述扩增产物I为模板，以P7及P12为引物扩增获得ZwW基因与_7心1基因的融合基因；所述P7和P12的序列如下P7 :5， -AAATCGCGAGCTCATGAATCACTCTGCTGAAT-3，，P12 :5’ -CGCGGATCCTTAGTTAGGTCTAACAAGGATTTTG-3’ ； 认budA基因与基因的融合基因和拼接序列I的重叠部分互为模板进行扩增，获得扩增产物2 ;以扩增产物2为模板，P13及P14为引物，进行扩增，获得ZwoS基因、ZwW基因和基因的融合基因；所述P13和P14的序列如下P13 :5’ -GTCTATGACCATGACTACGAGCTC-3’， P14 :5’ -CGCAGGATCCTTAGTTAGGTCTAAC-3’。
7.—种权利要求1-3所述基因工程菌在制备{R，/ ) _2，3-丁二醇方面的应用，其特征在于将基因工程菌接种至发酵培养基，在摇床转速18(T220r/min、35_38°C条件下发酵30 48h，收获含有{R，R) _2，3- 丁二醇的发酵液； 所述发酵培养基为葡萄糖80 200 g/L，蛋白胨5 10 g/L，酵母膏3 7 g/L, NaCl5 10 g/L，氨苄青霉素20 50呢/mL，溶剂为水。
全文摘要
本发明公开了一株产(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。所述基因工程菌，是将budB基因、budA基因和ydjL基因通过表达载体pTrc99a转化大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655得到的基因工程菌。本发明的菌株能够在不需要添加诱导剂的情况下，高产高纯度的(R,R)-2,3-丁二醇，同时细胞生长良好，底物消耗迅速，发酵周期较短，成本低。该工程菌的获得对生物制造(R,R)-2,3-丁二醇具有重要的工业应用价值。
文档编号C12N1/21GK102965324SQ20121050552
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者黄和, 纪晓俊, 沈梦秋, 聂志奎, 夏志芳 申请人:南京工业大学